一、标本的采集和储存 出现症状后72小时内采样。 二、所需材料 IDEIA™ norovirus试剂盒(DakoCytomation公司) 三、检测前准备 将试剂和待检测标本置于室温(15~30℃)30min。 四、标本准备 加入1ml样品稀释液至1.5ml 小离心管中,然后,加入0.1g固体粪便标本或0.1ml液体粪便标本,置于漩涡震荡器充分混匀,室温静置10min,室温下≥5000rpm离心5min,取上清进行检测或置-20℃冰箱保存备用。 五、检测步骤 1、将需要数量的微孔板置于微孔板架上。 2、每孔加入100µl 10%便悬液以及阴性对照,阳性对照。 3、每孔加入2滴(或100µl)酶结合物(conjugate),用枪头轻柔混匀(上下5次左右),20~30℃静置60±5min。 4、每孔加入350µl洗液(用手轻微摇动1 min左右),弃去洗液,在卫生纸上拍干,共洗5次。 5、每孔加入2滴(或100µl)底物液(Substrate),20~30℃静置30min。待蓝色显现后迅速观察颜色。 6、每孔加入2滴(或100µl)终止液(Stop solution),充分混匀。 7、读取OD450值,打印输出或记录值。结果必须在加入终止液后30min内读取。 六、结果判定 阴性对照:肉眼观察无色或OD450值<0.15。 阳性对照:肉眼观察呈现独特的蓝色或OD450值>0.50。 临界值(cut-off value):OD450值=阴性对照OD450值+0.10。 标本: a)肉眼观察蓝色比阴性对照颜色深判定为阳性,肉眼观察无色判定为阴性。 b)OD450值大于临界值判定为阳性,小于临界值判定为阴性,OD450值在临界值±0.01 范围内判定为可疑,应重复检测或重新取样。判断阴阳结果按上述方法进行。若OD450值在临界值仍在±0.01范围内,仍判定为可疑,对于可疑样品应用PCR方法来判定最终结果。 七、注意事项 1、便标本处理时震荡时应充分震荡,特别是成形便或稀便,以便于病毒从标本中释放出来。 2、加酶结合物(conjugate)后应用枪头轻柔混匀(上下5次左右),以便于抗原抗体充分结合。 3、读取吸光度应在加完终止液之后30min内完成。 4、所有标本和阳性对照必须被当作具有潜在感染性的物质进行处理。 5、打开后的96微孔板应置于可封口的有干燥剂的口袋中贮存于2~8℃,打开后6周内用完。 6、终止液中含0.46mol/L硫酸,避免接触到皮肤和眼睛。如果终止液接触到这些部位立即用水冲洗。 7、底物液避光保存,不使用已经变蓝的底物液。 8、避免试剂、金属离子、氧化性物质及微生物污染。 9、因标本中可能存在某些腺病毒,该病毒具有与眼结膜结合的能力,在检测过程中应避免手与眼的接触。 10、ELISA板微孔不能反复使用。 |
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