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标签: 风疹病毒 分离 标准程序

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目的

根据中华人民共和国国家标准(GB17009-1997)“风疹诊断标准及处理原则”,对风疹病毒分离作必要的细化和补充,规范风疹病毒分离方法。

适用范围

本操作细则适用于从咽拭子、尿液标本中分离风疹病毒。

操作细则

原理:病毒感染其敏感的靶细胞后,利用宿主细胞的细胞器、酶类及其能量进行病毒核酸复制,引起宿主细胞的形态学改变,出现细胞融合、坏死和脱落。

1、试剂来源

Vero/slam细胞由国家麻疹实验室提供,使用代次不超过15代。

2、操作步骤

2.1维持液的配制     100ml
      DMEM                                         96mL
      7.5%碳酸氢钠                              1mL
      胎牛血清                                      2mL
      青链霉素(10000U/mL)                  1mL

2.2细胞制备

在生物安全柜中将生长良好的成片Vero/slam细胞瓶塞拔下,倒去培养液,加4mLEDTA胰酶混合消化液,盖上瓶塞,当肉眼可见细胞层变成淡白色或显微镜下细胞开始圆缩为度,拔去瓶塞,倒去消化液,加入10mL生长液,用吸管沿瓶壁吹打,使细胞充分混匀。按所需细胞浓度加入营养液分装,10mL/瓶或5mL/瓶,放37℃孵箱内培养。传代后2~3天,在显微镜下观察单层细胞,以确保细胞生长良好,备用。

2.3标本的处理

2.3.1咽拭子标本:低温冻融三次,冻存于-70℃以下,备用。

2.3.2尿液标本:标本采集后24小时内送达试验室,离心处理(4℃,2000rpm,20分钟),弃上清,加入标本保存液1mL,低温冻融三次,冻存于-70℃以下,备用。

2.4标本的接种

2.4.1将标本融化,无菌吸取0.2-0.5mL(根据细胞瓶大小决定)接种到生长良好的单层vero/slam细胞瓶中,接种前倒去细胞培养液,使待检样品均匀地覆盖在细胞上,置35℃孵箱内吸附1~2小时,吸附期间应轻轻摇动2~3次,以避免细胞面干燥。另留1瓶细胞作为阴性对照。每一份标本接种1瓶细胞,并进行正确标记(包括标本编号、接种日期、传代数)。

2.4.2吸附完毕后,为防止标本对细胞产生毒性反应,弃去标本液,加入细胞维持液,每瓶5mL—10mL(大方瓶10mL/瓶,小方瓶5mL/瓶)。放35℃孵箱内培养。

2.5 结果观察

2.5.1每天在显微镜下观察方瓶中的细胞病变(CPE),并记录融合性细胞的产生过程。如果培养基太酸(由橙色变为黄色),需要更换细胞维持液。

2.5.2当出现典型的融合巨细胞病变+++时。将该瓶培养物冻存于-70℃冰箱,备作病毒鉴定之用。

2.5.3如经7天培养未出现细胞病变,则再盲传1代继续观察7天。由于风疹病毒的细胞病变不明显,连续传代2次的分离物应进行病毒鉴定后方可报告结果。

2.5.4细胞病变(CPE)的观察记录格式为:
      0~25%的细胞出现病变记录为“+”;
      25%~50%的细胞出现病变记录为“++”;
      50%~75%的细胞出现病变记录为“+++”;
      75%~100%的细胞出现病变记录为“++++”。

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