革兰氏染色是细菌鉴定上一个最重要和广泛应用的方法。根据此法染色结果可将细菌分成两大类。一类细菌能够保留初染色剂（结晶等）于细胞中，不受脱色剂（酒精）的影响，而最后细菌被染成紫色或深蓝色者称为革兰氏阳性（Gram-positive）；另一类细菌可因脱色剂的作用而洗出结晶紫，然后被另一染色剂（藏红花）染成红色，称为革兰氏阴性（Gram-negative）。也有一些菌种革兰氏染色是可变的。

【实验目的】

了解革兰氏染色的原理，并掌握革兰氏染色法的操作技术。

【实验原理】

革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法。1884年由丹麦医师Gram创立。

细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液媒染（以增加染料与细胞的亲和力）后，用酒精或丙酮脱色，再用复染色剂染色。不被脱色而保持原颜色者为革兰纸阳性菌（G+）；被脱色后又被染上复染剂的颜色者为革兰氏阳性菌（G-）。此法可将细菌分为两大类。

革兰氏染色的机理主要是利用两类细菌的细胞壁成分和结构不同。革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少。当用乙醇或丙酮脱色时，类脂质被溶解，增加了细胞壁的通透性，使初染后的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染液的颜色；而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量多且交联度大，类脂质含量少，经乙醇或丙酮洗脱后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，因此，细胞仍保留初染时的颜色。

【实验材料、药品及器具】

1、菌种   大肠杆菌（Escherichia coli）

枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

金黄色葡萄球菌（Staphylococeus auresu）

2、染液   草酸铵结晶紫液

          革兰氏碘液

          95%的酒精

          藏花红液

3、器皿洗净的载玻片6片、显微镜、酒精灯、接种环、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、镊子、玻璃缸、瓶装蒸馏水

【实验步骤】

1、取培养12-24h的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌分别涂片、固定。

2、加草酸铵结晶紫染色剂一滴，染色1分钟。

3、倾去染液并用洗瓶装水轻轻冲洗。

4、加碘液染1分钟，水洗，然后用吸水纸吸干。

5、将载玻片略倾斜，滴加95%酒精脱色（洗至流下的酒精中无紫色时为止），然后水洗。

6、加藏花红复染，染色30分钟，水洗，用吸水纸吸干或烘干。

7、用油镜镜检观察。