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病毒的超低温保存方法

标签: 病毒保存

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一、概述

大多数微生物可用超低温保存,超低温保存法是适用范围最广的微生物保存法。需要复杂营养的微生物种,如用其他的贮存方法不能保持其活力( 如植物的病原性真菌),通常可用超低温的方法保存(ATCC 1983;Halliday,Baker 1985)。此法是将冻存在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率(1℃/分钟)冷冻,直至-150℃,再将这些小管贮存在-150~-196℃的液氮中。

超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。ATCC 常用一种由甘油(10%)、二甲亚砜(5%)和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。这些化学试剂进入细胞内可避免内膜的冷冻损伤。

贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。当小管被加热时,所形成的冰晶会将细胞杀死,正确操作就可避免这种事故。只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失,做法是:将封口的小管迅速放入37℃的水中,直至所有的冰融化,然后打开管口,将内容物移入培养基。

超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中,因此需要液氮罐。在长期贮存的过程中必须经常注意补充液氮。这种贮存方式比冻干法需要更多的经费,包括为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。

二、材料

病毒超低温保存所需材料有:热收缩塑料管(Nunc Cryoflex),液氮罐,防护手套和面罩,永久性记号笔,气体喷灯,装液氮的保温瓶。

三、方法

(1)剪一段两端各超出冷冻管长度2cm 的热收缩塑料管。

(2)将含有澄清病毒悬液(组织培养的上清培养基,或组织培养基内的细胞溶解产物均可)冰浴几分钟,用灭菌移液管将0.2ml 冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内,并将盖子拧紧。

(3)将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部,插入正确的标签。

(4)用喷灯小心加热热收缩塑料管,并使之包住冷冻管。注意不要用太高的温度加热热收缩塑料管。

(5)再小心加热热收缩塑料管的两端,用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。

(6)将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻(操作时要求戴面罩和手套)。

(7)将冷冻过的冷冻管放入液氮罐中的格子内,同时记录样品的详细的存放位置、实验编号和存放日期等。

(8)需要用时,迅速从液氮罐内取出所需样品,并投入37℃水浴箱中解冻后,用解剖刀片在冷冻管的硅化垫圈处切开热收缩塑料管。拧开冷冻管的盖子时不需要除去热收缩塑料管

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