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支原体培养技术

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支原体又称霉形体,是很小的原核细胞,完全没有细胞壁.菌体形态多变,具高度多形性,球形、梨形、分枝的或螺旋的丝状等。营养要求苛刻,在高血清量的复杂培养基上生长,在固体培养基上菌落呈油煎荷包蛋样特征性外观。

培养基:牛心汤复合培养基等。分离培养:无菌采取肺、肝、脾、肾组织,直接剪成小块放在固体培养基上划一直线,再用无菌铂耳环在与其垂直方向划线,或者将组织块剪碎磨成匀桨,经液体培养基连续系列稀释后培养.若当液体材料为牛乳、排泄物、胎液等,可直接取0.2ML接种于液体培养基或取0.1ML接种于固体培养基。固体琼脂平板置37摄氏度潮湿需氧条件或在5%二氧化碳下培养48-96h,用斜射光或放大25-40倍的立体显微镜检查,若有特异菌落出现,应选取散在的单个菌落用无菌解剖刀切下小琼脂块,用巴氏吸管小心地将菌落和周围琼脂吸入,再将其移入盛有2-3ML的液体肉汤培养管培养48h,将其培养物通过0.45微升孔径大小的滤膜过滤后作1:10和1:100稀释,每一个稀释液取0.05ML涂布于几个琼脂平板,即可得到纯的支原体培养物。

牛心汤复合培养基:
  牛心汤1000ml
  蛋白胨10g
  氯化钠5ml
  酵母提取液10ml
  无菌马血清200ml
  1.25%醋酸铊溶液20ml
  青霉素200IU/ml

实验 支MP 肺炎支原体培养实验

一、标本采集

支原体常侵及人和动物的粘膜表面,一般可用棉花拭子涂抹取样后放入2~3ml支原体液体培养基的小管中,或取其分泌液,若标本是组织块,可在灭菌乳钵或玻璃匀浆后接种,取样后应尽快接种培养。

二、分离培养

1、支原体固体培养基接种法 转动拭子将标本液体尽量挤出,用无菌滴管吸1~2滴接种在平皿上盖好,用L棒涂抹或倾斜转动平皿使标本均匀分布,置37℃孵育。

2、支原体半固体培养基接种法 混种法:在制备半固体培养基时,培养基加热溶化,温度降至50℃时,添加动物血清、酵母浸液及青霉素后混匀,待冷却至37~40℃时,用无菌滴管吸取标本0.5~1ml加入培养基中,充分混匀,凝固后置37℃孵育。

3、穿刺接种法:方法同细菌接种法。

三、结果观察
  绝大多数支原体为兼性厌氧,少数在含10% CO2和相对湿度80~90%的大气环境中生长良好。支原体生长缓慢,多数于3~4d长出菌落,少数于1~2w方长出典型菌落,在平皿固体培养基上生长的菌落呈"油煎蛋"状,边缘不整齐。

四、附录
  糖酵解培养基(肺炎支原体培养基)
  基础培养基 70ml
  马(或牛血清) 20ml
  25%酵母浸液 10ml
  0.4%酚红 0.5ml
  1%醋酸铊 2.5ml
  青霉素10000IU/ml 5.0ml
  调pH 7.8
  肺炎支原体培养很简单的,特别是液体培养,不需要防护!
  配方上面的有点复杂而模糊,简单:
  PPLO 21g(商品化买)
  酵母粉 6g(OXIDE)
  马血清 200ml(没有的话用小牛血清代替)
  L-半胱氨酸 0.3g
  葡萄糖 10g
  1%酚红 4ml
  AMP 若干(0.1-0.2g,多加点不影响,但醋酸铊有毒性的,我不加)
  这些够了,我有时还加SMZ和TMP!
  ph要调的,大概在7.5-7.6之间吧!
  酚红可以高压的!

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