SPA提取的方法很多,包括煮沸法、溶菌酶法、葡萄球菌溶素法、超生波法以及三氯醋酸法等。现将常用的方法介绍如下:
1.煮沸提取法
⑴ 将菌株接种于蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上,37℃培养20h~24h。 ⑵ 以0.15mol/L pH5.9PB液将菌苔洗下,配成10%(V/V)的悬液。 ⑶ 水浴中煮沸1h,迅速冷却至4℃,4000r/min离心20min,去沉淀。 ⑷ 以1mol/LHCl将上清液调pH至3.0~3.5,然后4000r/min离心30min。 ⑸ 沉淀以pH5.9PB溶解,然后12 000r/min离心20min。 ⑹ 上清液加4.7倍量的95%酒精,充分混合后,4000r/min离心20min。 ⑺ 沉淀(可直接冻干为粗提SPA制品)加PH7.4PBS液溶解,12000r/min离心20min。 ⑻ 上清液即为粗提SPA液。 ⑼ Sephadex G100过柱,上样后用0.05mol/L pH7.4 PBS液洗脱,流速控制在每管2ml~3ml/20min,收集流出液。 ⑽ 测OD275nm值及用对流免疫电泳检测每管的活性,将有活性的各管合并、浓缩或冻干。
2.溶菌酶消化法
⑴ 将培养的SPA菌以pH 8.0 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液配成10%~15%的悬液。 ⑵ 按20:1(W/W)的量加入SPA菌液与溶菌酶(活力为1万U/mg蛋白)37℃水溶搅拌24h。 ⑶ 置4℃冷却后,以12000g离心30min。 ⑷ 取上清,调pH值至7.0。 ⑸ 加硫酸铵,边加边搅拌,使溶液呈80%的饱和度,4℃过夜。 ⑹ 12000g离心30min。 ⑺ 以少量蒸馏水将沉淀溶解。 ⑻ 透析或过Sephadex G50除盐,即为粗制的SPA制品。
|