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保证质量评价的准确可靠。
【作用】Ⅷ 药敏试验的标准操作程序
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实验室名称
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项目
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编号
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制定日期
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药敏试验
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**年**月**日
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一、K—B法
【目的】
保证纸片扩散法药敏结果的可靠性。
【材料】
（一）培养基
Mueller-Hinton琼脂平板，只适合肠杆菌科、铜绿假单胞菌、不动杆菌、葡萄球菌、肠球菌、霍乱弧菌；HTM琼脂，只适合嗜血杆菌；GC琼脂＋1％特定的生长因子，只适合淋病奈瑟菌；Mueller-Hinton琼脂＋5％羊血，只适合链球菌。
（二）药敏纸片
抗菌药物纸片直径约为6.0-6.35mm，每片的吸水量约20ml。
（三）质控菌株
K-Β法质量控制用菌株常规用：金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853。
（四）菌液比浊管
接种菌液浓度为1.5x108/ml，相当于0.5的麦氏比浊管。
【方法】
1.制备接种菌液：挑选琼脂平板上，形态相同的菌落移种于M-H液体培养基中，置350C温箱中孵育4小时，校正浊度，或用接中环挑取菌落，置浮于生理盐水中振荡混匀后与标准化浊管比浊，调整浊度与比浊管相同。
2.接种平板：用无菌棉签蘸取已制备好的接种好的菌液，在管壁上旋转挤压九次，去掉过多的菌液，涂布整个M-H培养基表面，并将平板旋转60℃，反复几次，最后沿平皿周边绕两圈，保证涂布均匀。
3.贴纸片：待平板上的水分被琼脂完全吸收后（约15分钟），用无菌镊子取纸片贴在琼脂平板表面，并用镊尖轻压一下，使其贴平。每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。
4.孵育：把贴好药敏纸片的平皿放进350C孵平板，最好单独摆放，不超过2个叠在一起，孵育18-24小时后，读取结果。
5.判定结果：培养后取出平板，用游标卡尺测量抑菌环的直径，抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限，然后根据抑菌环直径大小、NCCLS判断细菌的敏感性，并加以记录。
二、稀释试验
【目的】
1.为了决定抗生素的最低抑菌浓度（MIC）。
2.为了决定抗生素杀菌能力，或实验两种以上抗生素对细菌的协同作用或对抗作用。
【方法】
（一）肉汤稀释试验
1.适用情况：
[1] 血液培养。
[2] 病人对适当治疗方法无效。
[3] 免疫机能障碍病人
[4] 病人经治疗后复发者。
2.培养基的选择：
一般细菌用调节好阳离子的M-H肉汤（CAMHB），如肠杆菌科、铜绿假单胞菌、不动杆菌、葡萄球菌、肠球菌、霍乱弧菌；某些挑剔性细菌则根据其生长的营养需要，向M-H肉汤中加入适当的营养物进行实验，如HTM肉汤，只适合嗜血杆菌；CAMHB＋2－5％冻融马血，适合肺炎链球菌以及以外的链球菌。
3. 肉汤的连续稀释：
[1] 将各种抗微生物药物库存液稀释成200ug/ml或200u/ml。
[2] 取10支无菌试管，写上编号1-10，为一组每种抗生素需一种。
[3] 自第2管至10管各加入无菌肉汤1。0
[4] 将各实验药分别加1.0ml至第1管及第2管，将第2管混匀后移取0.1ml至第3管，同样操作，倍比稀释至第9管，第10管不加抗生素作为阳性生长对照。
[5] 另外准备仅含肉汤的试管，作为阴性对照。
4.细菌的接种
[1] 每支试管接种1.0ml菌液（约105-106个细菌/ml），也可将细菌调至0.5个麦氏浊度再用肉汤稀1：200然后接种1.0ml至每支试管内。
[2] 接种后每支试管含混合液，抗生素浓度为512ug（u）-O.125ug（u）。
[3] 若细菌对某种抗生素特别敏感，可把操作液先稀释10倍，再予连续2倍稀释，最后的浓度为10；5；2.5；0.6；0.3；0.15；0.08；及0.04ug/ml。
5.培养和结果的判断
在350C温箱中培养16-20小时后，肉眼观察生长情况，阳性对照管可见浑浊生长，阴性对照管则应清澈。
以抗生素能抑制细菌生长管的最低浓度为其MIC值。
6.测量最低杀菌浓度（MBC）
把无菌生长的每一试管吸0.1ml加到500C的胰蛋白胨肉汤（Tryptic soy broth,TSA）20ml混合均匀后分别倒平板，培养48-72小时后计算菌落数，和1：200稀释原菌液作倾注获得的细菌数相比，减少99.9％，其最小抑菌浓度为可得到抗生素的MBC值。一般在实际运用中，采用定量接种环（0.001毫升）涂化平板，孵育后，平板菌落计数小于5个，其抑菌浓度为最小杀菌浓度。
7.质控：利用NCCLS建议的标准菌株进行质控。
（二）微量肉汤稀释敏感实验
手工法：原理与试管稀释方法相同。具体操作是在含有96小孔的小塑料培养盘进行，每一孔可装0.1ml量，每一盘可同时作数种抗生素的数种不同浓度，另2孔作为阳性与阴性对照。
仪器法：配制仪器Minidiluter或MIC-2000（美国）Dynatech labortories，Alexandria，VA）自配或购买现成的实验培养基。
（三）琼脂稀释法
1此法与肉汤稀释实验原理相同，但又有其优点：①可同时实验许多菌株，利用多点接种仪可同时接种多个菌株到一系列含有各种不同抗生素浓度的平板。②可检测是否污染：由细菌在平板上生长的特性判断。③可对肉汤稀释实验结果不佳的挑剔性细菌进行实验。
2.琼脂培养基的选择：一般使用M-H琼脂，它适合肠杆菌科、铜绿假单胞菌、不动杆菌、葡萄球菌、肠球菌、霍乱弧菌；对挑剔的细菌可加入相应的营养物，如巧克力、动物血、5%脱纤维血或冷冻动物血等，如HTM琼脂，只适合嗜血杆菌；GC琼脂＋1％特定的生长因子，只适合淋病奈瑟菌；Mueller-Hinton琼脂＋5％羊血，只适合肺炎链球菌以外的链球菌。
3.抗生素稀释与平板的配制。
4.平板的接种：
[1] 每一试验菌株需调整浓度至0.5麦氏浊度。
[2] 平板点接种可用定量接种杯（0.001ml）、毛细吸管或自动接种仪器进行。
同时作5个对照菌株作为质控：大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218、金黄色葡萄球菌ATCC29213、粪肠球菌ATCC29212。
5.待接种菌液被完全吸收后，倒置培养在350C温箱内。
6.结果的判断：16-20小时后，首先看不含抗生素的对照平板，必须有一株生长，然后看各实验平板，凡能完全抑制细菌生长的抗生素最低浓度即为MIC值。
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操作人员 部门主管 质量负责人
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姓名 ****** ****** ******
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日期 **年**月**日
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Ⅸ 药敏实验室内质量控制的标准操作
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实验室名称
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项目
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编号
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制定日期
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药敏实验室内质量控制
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**年**月**日
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【目的】
保证药敏报告的准确性，可靠性及重现性。
【该SOP变动程序】
本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。
【适用范围】
琼脂纸片扩散法。
【方法】
一、培养基
纸片扩散实验必须使用M-H琼脂培养基，因为它不含抑制磺胺药物，而其他种类培养基可能含有与磺胺药拮抗的物质，使其抑菌环变小。
1.培养基的制作过程必须统一，无论是培养基或添加物的剂量、PH值、高温灭菌的时间或温度都需遵照规定，
2.新的粉状脱水培养基打开时，要附厂商、编号、日期、及打开者的姓名。
3.无菌实验：每一批配好的培养基其中抽取5%的量在 350C或其他适合的温度下隔夜培养，观察有无菌落生长。
4.若是新购的培养基必须观察其颜色与透明度，若有沉淀、浑浊或脱水的现象都必须丢弃，新配好的M-H培养基，用塑料袋包好，储藏于40C的水箱内，防水蒸发。
5.平板所含培养基的量太多或太少均不宜，如Mueller—Hinton agar的高度不可超过4mm，否则会影响抑菌环的直径（变小）。
6.定期检测培养基的有效性，并对结果加以记录，以便能随时发现问题。
7.培养基要在有效期内使用。
二、试剂
鉴定细菌实验所用的纸条或纸片，储藏于冰箱时，须附干燥剂，且须注意所标明的有效期限。纸片购入时须作阳性与阴性对照以检查其是否有效，以后可每周做一次。
三、抗生素粉末与抗生素纸片
检查室诊断过程中所用抗生素粉末必须保持干燥，置冰箱储藏，若其制成高浓度的库存溶液，应该采取少量分装于各小瓶，贮存于-140C或-140C以下，一旦取出解冻，未用完的就应丢弃。若抗生素粉末用于稀释试验时，须限已知MIC的微生物作对照。
作药敏用的抗生素纸片应放干燥剂并贮存于-140C或-140C以下，若情况不允许，除了penicillins、cephalosporins及oxacillin纸片仍必须冰冻外，其余可置冰箱贮存。从冰箱取出装抗生素纸片的容器，须待其复温至室温后才能打开使用。
每天在作药敏试验时，最好同时取已知敏感的微生物质控菌株作对照，来测验纸片的功效。
四、装备
1．培养箱、冰箱等装备于每天早上上班时须记录温度并校正，使用过程中应注意温度有无变化。
2．CO2 培养箱，要确保其所含的CO2量。
3．厌氧缸在使用时，催化剂要先在1600C干燥箱中加热1-2小时，使其恢复功能，且同时于缸中放入生物指示剂可确定是否绝对无氧。
五、操作人员素质
操作者应熟悉药敏试验的规范步骤，尤其要注意其影响因素，如：接种菌的浓度不能太高或太低，应标准化；接种要用无菌棉拭子，不可用接种针或接种环，且要使接种菌在平板上分布均匀；纸片间距要合适等。
六、结果判读
纸片扩散敏感性试验只适用于快速生长菌，不可用于缓慢生长菌，一般培养16-18小时后读取结果。并根据NCCLS抑菌环的判读标准判断药物的敏感与否，但要注意NCCLS的标准常因菌种而异。
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操作人员 部门主管 质量负责人
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姓名 ****** ****** ******
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日期 **年**月**日
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Ⅹ 微生物学检验室间质评的标准操作程序（SOP）
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实验室名称
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项目
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编号
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制定日期
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微生物学检验室间质评
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**年**月**日
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【目的】
1.综合判断实验室的工作水平。
2.作为实验室外部的一个公众质量控制标准。
【该SOP变动程序】
本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任
【方法】用模拟临床标本做质量评价
将细菌接种在培养基或制成冻干菌种，并把它当作某种临床标本，发给各个实验室。各个实验室根据该标本的性质及有关模拟的临床指征，按照日常的操作方法进行相应的分离鉴定及药敏试验，结果回报给组织机构，经过统计分析后再反馈到实验室。根据反馈的资料，实验室可以做自我评价。组织机构在反馈的资料中，可以根据各个实验室的检验结果给出所计算的得分，作为评价时的一项比较直观的指标。
（一）用日常临床标本的检验结果做质量评价
用于日常临床标本的检验结果做质量评价的指标有两方面：
1.细菌分离率：各类感染的病原菌特点相对稳定。比如急性呼吸道感染，常见的病原菌是肺炎链球菌和流感嗜血杆菌。分析一个实验室对呼吸道标本该类细菌的分离率，可判断其对呼吸道细菌感染的诊断能力。实验室很少或分离不到此类细菌，说明有漏检和误诊。
2.细菌耐药率：细菌的耐药性也相对稳定，社会上有公认的耐药率。比如，金黄色葡萄球菌对青霉素G的耐药率达90%，对万古霉素无耐药或耐药率很低。一个实验室的检验结果如果与其他实验室的结果不同，应做质量分析。
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操作人员 部门主管 质量负责人
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姓名 ****** ****** ******
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日期 **年**月**日
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