1. 适用范围

本标准适用于BECKMAN 125型高效液相色谱仪的使用操作。

2. 目的与意义

规范BECKMAN 125型高效液相色谱仪的使用操作，保证高效液相测量结果的准确性。

3. 责任

质量分析人员全面负责本SOP的实施。

4. 仪器的组成

本系统由SYSTEM GOLD^® 125溶剂输送泵、SYSTEM GOLD^® 166检测器（190～360 nm）、Rheodyne 7725i手动进样阀、HT-330 柱温箱、BECKMAN色谱工作站、打印机等组成。

5. 操作步骤

5.1. 准备

5.1.1 准备所需的流动相，用合适的0.45μm滤膜过滤，超声脱气20min。

5.1.2 根据待检样品的需要更换合适的色谱柱（注意方向）。

5.1.3 配制样品和标准溶液，用合适的0.20μm滤膜过滤。

5.2. 开机

接通电源，依次开启泵、检测器开关，打开计算机进入win2000操作系统，双击桌面的32 Karat图标进入主菜单对话框，双击instrument图标进入色谱分析界面（包括Direct Control、Det166、Instrument Setup等界面）。

5.3. 创建分析方法

可在Direct Control界面直接点击各设备单元的图像进行流动相比例、流速、最大压力限、最小压力限、检测波长以及检测器开启与关闭等参数的设定，亦可点击“Methed/Instrument Setup” 进行相应的设定，然后点击“File/Methed/Save As”保存设定的方法。

5.4. 更换流动相并排气泡

将管路的吸滤器放入装有流动相的储液瓶中，逆时针转动排液阀90～180°，打开排液阀；设流速为5ml/min，冲洗3min后设流速为0停泵，将排液阀顺时针旋转到底，关闭排液阀。如管路中没有气泡，则排气泡操作可省略；如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。

5.5. 平衡系统

用流动相冲洗至基线漂移<0.001AU/min，噪声为<0.0005AU时，可认为系统已达到平衡状态，可以进样。

5.6. 输入样品信息

点击“Control/Single Run”，在Sanple ID（样品名称）、Method（方法）、Data path（保存路径）、Data file（文件名）输入相应的信息，然后点击Submit提交。

5.7. 进样

在“Direct Control”界面点击“AutoZero”键调零；用进样针定量吸取样品溶液，在进样阀处于“INJECT”状态下插入进样针；逆时针转动进样阀手柄，在“LOAD”状态下推针进样，再顺时针转动进样阀手柄使其回至INJECT状态即完成进样操作。

5.8. 报告输出与打印

在主菜单对话框内右击“Instrument”图标，点击“open offline”进入离线分析界面。

5.8.1 系统默认报告格式：点击“File/Data/New”打开相应文件后，点击“Report/View/Area%”。

5.8.2 自定义报告格式：点击“File/Data/New”打开相应文件后，在该界面中单击鼠标右键，点击“Graphical programming/Define Peaks”，在色谱图中单击自定义峰的起始和终点位置，点击“File/Method/Save”进行方法保存；点击“Report/Analyze”，进行自定义报告的分析；点击“Method/Custom Report”，在弹出的界面中分别点击“Insert field”、“Insert Graph/Data Graph”和“Insert Report/Run Report”即可分别插入常规信息、图谱、数据，从而完成自定义报告。

完成报告输出后，点击“Report/Print/Area%”或者“Report/Print/ Custom Report”即可打印报告。

5.9 关机

5.9.1 测定完毕后，在Direct Control界面点击检测器图标关闭紫外灯。

5.9.2 色谱柱的冲洗

5.9.2.1 反相柱（C₈、C₁₈）：流动相含盐的（可将加酸、加三乙胺等情况并入），以乙腈-水（5：95）（乙腈可用甲醇代替，下同）冲洗30min（可视具体情况增加冲洗时间，下同），然后以乙腈冲洗20 min以上；流动相不含盐的，以流动相冲洗10min以上，然后以甲醇冲洗20 min以上；流动相添加离子试剂的，以乙腈-水（5：95）冲洗45min以上，然后以乙腈冲洗20min以上。流速一般设为1ml/min。

5.9.2.2 正相柱：流动相含盐的，以不含盐流动相冲洗30min以上，再以正己烷冲洗20min以上（如流动相极性与正己烷有较大差异，可在流动相冲洗后，以异丙醇低速冲洗进行过渡，注意以异丙醇为流动相流速不得超过0.5ml/min，下同）；流动相不含盐的，以流动相冲洗20min以上，再以正己烷冲洗20min以上。

5.9.3 停泵，逐级关闭工作站窗口，关闭计算机及仪器各部件电源开关。

5.10 填写仪器使用记录

6. 注意事项

6.1 流动相及样品溶液必须用0.45um滤膜过滤，流动相还要进行脱气处理。

6.2 进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20μl的定量环最少进样60至100μl的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。推荐采用100ul的平头进样针配合20ul满环进样。

6.3 待泵的压力稳定后，方可开启检测器。

6.4 试验结束后，待泵的压力逐步降为0后，方可关闭泵的电源。

6.5 仔细阅读色谱柱说明书，保证色谱柱系统的适应性（流动相pH 2～8；柱压小于2.5 KPSI）。