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毛细管电泳仪的使用

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准备工作

1. 毛细管的制备:

①  剪略长于需要长度的毛细管(使用专用的裁剪纱布),断端利用镊子小心移除。

②   烧窗:从毛细管进液端开始到实验者需要长度的位置烧窗,窗口尽量小,过程中可用防护工具对窗口两端的毛细管进行防护,烧好的窗需用粘有酒精的棉花擦拭。

注:检测的有效长度为从毛细管进液端到检测窗之间的距离,这个距离一般根据实验者的需要自己掌握。

③   取出卡槽:打开安放卡槽区域的门,旋转固定卡槽的杠杆90度,按卡槽中央的释放按钮,握住卡槽的两端向上抽出卡槽。

④   安装毛细管:将进液端的毛细管小心的从卡槽的出口插入,进入时可轻轻旋转。当窗口到达检测点时停止插入,将游离的进液端毛细管从卡槽的入口引出,并固定好毛细管外端的橡胶管。

注:插入毛细管时小心操作,窗口位置的毛细管非常容易破裂,需格外谨慎,过程中切忌使用暴力。

⑤  安放卡槽:用与取出的步骤相反顺序的操作安放卡槽。

2.  添加样品,缓冲液及冲洗液:

①  为了减少样品及缓冲液的挥发,在插入加液管前可在加样管固定器的小孔内加入少量的ddH2O。

②  已添加好的加液管,在插入转盘上的固定槽前先离心2min,加液时注意加样枪头紧贴管壁,防止气泡的产生。

③  为了减少虹吸作用,需要保持入口处和出口处的running buffer量一致,对于500ul体积的加液管,推荐加入500ul的剂量;对1.5ml体积的加液管,推荐1.3ml的剂量。

④  推荐加入样品的最小剂量为50ul,检测需要的最小剂量为15ul。

⑤  在出口处的waste管中加入50ul的ddH2O,可以防止检测端的毛细管被冲洗液的残留污染。

电泳仪的操作

1. 插上电源,检查电泳仪的连接情况,检查制冷区小槽内水量是否充足,打开电脑,打开电泳仪的开关(两扇门都需要关闭),在电脑桌面点开BioFocus的图标,进入到BioFocus的控制界面。

2. 设置程序:

①  点击Reagents键,在已有的Reagents Data Base中查看是否含有需要使用的配液,有可点击该配液查看,或使用edit键进行修改;没有则点击add进行编辑添加。添加之后注意命名名称的唯一性。

②  点击Cartridges键,对卡槽的相关参数进行查看,修改。如Cartridges Data Base中没有和试验要求匹配的配置参数则点击Add进行添加。注意需要激活相应的或者设置的卡槽。

③  点击Configurations→Define添加需要的信息:configuration ID;Configuration description;select the cartridge→Continue:Regent双击左下角regent data base中需要选择的regent,双击屏幕右边你需要放置该regent的Inlet Carousel Position→Sample:命名,同样的方式从左下角的Reagents中添加到右侧相应的位置上→点击empty,然后点击需要删除的Regent;点击clear,清除所有设置的Regent摆放次序→OK。

注:在以上几步中,记得同时设置好中止的清洗程序,及Shutdown程序,ddH2O清洗5分钟,氮气吹干。

④  点击Methods:选择设置好的程序→Define:填写Method ID,Description→Inlet Regent ,选择电泳中需要的Running buffer →Outlet Regent ,选择电泳中需要的Running buffer→Voltage Mode填写需要的电压,电流, 正负极,设定电泳时毛细管需要的温度,以及电泳时间→Add:添加在电泳前后需要灌注的洗液等,填写灌注的时间→Injection:选择电压或者气压的进液方式;前者需选择恒压或者恒流,以及进液时间的长短;后者需选择压力*时间的进液常数→Detector:Detector Parameters:设置波长,时间,通道,AU范围;Display parameters:设置波长,AU范围,偏移;Options:设置Rise Time,Turn off lamp at run end;Designation:该设者存储的位置→OK。

⑤  点击Auto Seqs:选择需要的程序→Define查看,编辑需要调整的程序,如States显示Conflict则需要对相应的设置进行调整,直到状态显示Pending →Pending, Ready →OK→Start。

停止,存储,查看文件

 等待所有的程序完成后(包括运行程序及情节程序),要停止运行的程序,则可点击屏幕左上角的Stop键→选择需要中止运行的某一步(Abort Current Run Only),某一组(Abort Current Run Group)或所有编辑的程序(Abort Automation Sequence)→OK→存储在指定盘上(Yes),自定义盘(NO)→需要取出加液管及转盘(YES),不需要(NO)。

注:在所有的对话框消失之前,以及转盘没有回到初始位置之前,不能打开电泳仪的门。

操作要点

1. 将毛细管电泳仪放置于有空调的房间,保持室温恒定。同时,操作中控制毛细管及仪器恒温。

2. 缓冲液加压一段时间后,淌度和电渗流会变化,要经常更换。

3. 缓冲液要用0.45mm微孔滤膜过滤后使用。

4. 对未涂渍的毛细管柱每天使用前先用0.1mol/L氢氧化钠溶液、水及运行缓冲液各冲洗10min平衡后使用。更换缓冲液时,要用水冲洗3min后,再用缓冲液冲洗10min平衡后进样。

5. 样品宜溶于稀释5~10倍的运行缓冲液中,以获得好的峰形。

6. 为提高定量准确性,宜加入一内标。在保证峰形的前提下,样品宜用高浓度,进样时间应大于5psi×sec。

7. 摸索实验条件时,可先用一短柱,用磷酸盐、硼砂或Tris在不同的pH值条件下试验,当选定缓冲液种类时,可先改变pH值获得最佳分离,再改变浓度以获得较好的峰形及柱效。为使分析高效、快速,电压一般可用18~20kv。

8.每次作完实验后,用水冲洗5min,可将毛细管两端置于水中保存,也可用氮气吹干后保存。

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