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  免疫标记技术(immunolabelling technique)是指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为示踪物,标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。借助于荧光显微镜、酶标检测仪等仪器,对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定,可在细胞、亚细胞以及分子水平上,对抗原抗体反应进行定性和定位研究;或应用各种液相和固相免疫分析方法,对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性定量测定。根据标记物的种类和检测方法不同,免疫标记技术可分为酶联免疫吸附技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、发光免疫测定技术等。 
(一) 荧光免疫法
原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮,检测产物发出的荧光,荧光强度与Mb浓度呈正比,可在8min内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好,线性范围宽,具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例,首先将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体。除去未结合抗体,然后加受检标本,使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物,接着加入荧光标记的抗体,使之与抗原特异性结合,形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度,即可对蛋白抗原进行定量。
  传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大,时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕,作为标记物,加入正常液后激发测定,能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
(二) 放射免疫法
放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原,竞争性地与抗体结合,形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物,并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法,将抗原—抗体复合物与游离抗原分离,分别测定其放射性强度与标准曲线比较,即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强,可准确定量到ng/ml水平。但早期的方法操作麻烦,耗时长,且有放射性污染。近年来,随着单克隆抗体的应用,RIA的灵敏度又有了较大提高,且操作大为简化,并已有商品试剂盒供应,使用方便。
(三)  酶联免疫法(ELISA)
ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立,该法的最低检测限为10μg/L,线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高,特异性强,精密度好,操作简单,适用于多份标本的检测,不需特殊仪器设备等优点,易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。
以双抗法为例。首先包被抗原,然后加入一抗,使一抗与包被抗原形成抗原—抗体复合物。接着加入酶标二抗,形成抗原—抗体—抗体复合物。最后加入底物,由酶催化底物生成产物。通过产物的生成量即可对蛋白抗原进行定量。
(四)偶联生物素—亲和素系统的酶免法
利用了一个亲和素分子可以与4个生物素分子结合的特性,使传统的灵敏度较高的酶免法的灵敏度又有明显的放大作用。
(五)时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析(Timeresolved Fluoroimmunoassay, TRFIA)是一种非同位素免疫分析技术,它用镧系元素标记抗原或抗体,根据镧系元素螯合物的发光特点,用时间分辨技术测量荧光,同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨,可有效地排除非特异荧光的干扰,极大地提高了分析灵敏度。
(六) 解离增强镧系元素荧光免疫分析
解离增强镧系元素荧光免疫分析(Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay DELFIA)是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结构的螯合剂,使其一端与铕(Eu)连接,另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接,形成EU标记的抗体/抗原,经过免疫反应之后生成免疫复合物。由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱,因此加入一种增强剂,使Eu3 从复合物上解离下来,自由Eu3 同增强剂中的另一种螯合剂螯合形成一种胶态分子团,这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光,信号增强了百万倍。因为这种分析方法使用了解离增强步骤,因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。

B 免疫荧光技术
抗体是椎动物为防御感染所产生的免疫球蛋白。它们在蛋白质中是非常独特的一类,自然界中数百万种不同类型的抗体,每种类型的抗体都有一个与抗原结合的特异部位,通过这个部位的结合,就能特异地辨认出诱导它产生的抗原分子。这些抗原包括:蛋白质、细菌、病毒、花粉、食物、动物血清等等。
免疫荧光抗体技术,就是用荧光染料标记抗体,然后在荧光显微镜下通过荧光的部位和强度,确定特异分子的分布和数量。免疫荧光技术的关键是:(1)必须保持样品的抗原性,(2)设立严格的对照。

酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay ,ELISA)

ELISA是根据酶免疫测定原理发展的一种固相免疫酶技术。其原理是:抗原或抗体结合到固相载体表面仍保持免疫活性;抗原或抗体与酶结合形成的结合物仍保持其免疫活性和酶活性;结合物与相应抗体或抗原反应后,免疫复合物上标记的酶在遇到相应底物时,可以催化底物水解、氧化还原,从而产生有色物质,其颜色的深浅与相应的抗体或抗原有关。

ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂:①固相的抗原或抗体,②酶标记的抗原或抗体,③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件,可设计出各种不同类型的检测方法。ELISA有三种基本类型:间接法、双抗体夹心法、竞争法。

(一)间接法测抗体

  间接法是检测抗体最常用的方法,其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体,故称为间接法。操作步骤如下:

  (1)将特异性抗原与固相载体连接,形成固相抗原:洗涤除去未结合的抗原及杂质。

  (2)加稀释的受检血清:其中的特异抗体与抗原结合,形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合,在洗涤过程中被洗去。

  (3)加酶标抗抗体:与固相复合物中的抗体结合,从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后,固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。

 (4)加底物显色:颜色深度代表标本中受检抗体的量。

本法只要更换不同的固相抗原,可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。

(二) 双抗体夹心法

  双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:

  (1)将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体,洗涤除去未结合的抗体及杂质。

  (2)加受检标本:使之与固相抗体反应一段时间,让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合,形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

  (3)加酶标抗体:使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

  (4)加底物:夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

  根据同样原理,将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物,即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

 (三) 双位点一步法

  在双抗体夹心法测定抗原时,如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体,则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作,缩短了反应时间,如应用高亲和力的单克隆抗体,测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。  

(四)竞争法

  竞争法可用于测定抗原,也可用于测定抗体。以测定抗原为例,受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合,因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下:

  (1)将特异抗体与固相载体连接,形成固相抗体。洗涤。

  (2)待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液,使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原,则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原,则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合,竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会,使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原,保温后,酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。  

(3)加底物显色:参考管中由于结合的酶标抗原最多,故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差,代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡,表示标本中抗原含量越多。

  (五)捕获法测IgM抗体

  血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在,后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法,先将所有血清IgM(包括异性IgM和非特异性IgM)固定在固相上,在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下:

  (1)将抗人IgM抗体连接在固相载体上,形成固相抗人IgM。洗涤。

  (2)加入稀释的血清标本:保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。

  (3)加入特异性抗原试剂:它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。

  (4)加入针对特异性的酶标抗体:使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。

  (5)加底物显色:如有颜色显示,则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在,是为阳性反应。

双抗体夹心法检测乙型肝炎病毒表面抗原

    【原理】 以特异性的抗体(抗-HBsAgIgG单克隆抗体)包被载体表面,然后加入可能含有相应抗原的待测血清,孵育后洗涤,再加酶标记的特异性抗体(辣根过氧化物酶标记的抗HBsAg单克隆抗体)一起孵育。包被的抗体、待检抗原和酶标抗体形成夹心式复合物。洗去未结合的物质,加入底物显色,根据颜色的有无或颜色的深浅,定性或定量检测抗原(HBsAg)。

    【器材与试剂】 1.湿盒、滴管、微量移液器等。

    2.HBsAg酶标试剂盒。

    1)抗体:酶标抗HBs(用辣根过氧化物酶标记)。

    2)抗原:HBsAg阳性血清,阴性血清。

    3)底物:邻苯二胺(避光保存)、3%H2O2。

    4)载体:聚苯乙烯微量凹孔板。

    5)包被缓冲液(pH9.6 0.05mol/L碳酸盐缓冲液)、底物缓冲液(pH5.6 0.05mol/L柠檬酸—磷酸盐缓冲液)、洗涤液(NaCl 9克、吐温-20 5ml,加蒸馏水至1000m1)。

    3.待测血清、冻干小牛血清、蒸馏水、4N H2S04。

    【方法】1.用抗体包被凹孔板,使之固相化:

    1)配制包被抗体溶液:先用lml左右包被缓冲液注入包被用抗-HBs,并用滴管将此抗体移入包被缓冲液中,摇匀即成。

    2) 吸取包被抗体溶液加入凹孔板的孔内,每孔200μl。将此凹孔板平置于湿盒中,于37℃作用1~2小时后,再置4℃冰箱过夜。

    3)漂洗:

    倒出孔中液体,用洗涤液注满,放3分钟后倒去拍干,如此重复3次。拍干备用。

    2.加样品使之与板上的抗-HBs结合:   

    1)加样品:将待检血清、阳性血清、阴性血清及洗涤液分别加至各凹孔中,每孔200μl,作好标记后,平置湿盒内,放37℃孵育40分钟。

    2)漂洗:操作同上。

    3.加酶标记抗-HBs,使之与HBsAg结合:

    1)配制酶标抗-HBs应用液:以酶标抗-HBs和冻干小牛血清各1支,分别注入 lml左右洗涤液,摇匀后两支合并,再用洗涤液稀释到9~10ml,摇匀。

    2)每孔加酶标抗-HBs应用液200μl,平置湿盒内,于37℃孵育20分钟 

    3)漂洗:操作同上。

    4.加酶的底物溶液,使之在酶的催化下显色:

    1)配制底物溶液:将底物缓冲液加到底物中,使之完全溶解后加3%双氧水100μl,混匀(底物溶液应在临用前配制,冰箱避光暂存)。

    2)每孔加200μl底物溶液,避光置室温15~30分钟。

    3)中止反应:于每孔中加H2SO4(4N)溶液50μl,使酶反应中止。

    【结果】

    1、目测法:中止反应后立即在白色背景上用肉眼观察结果,阳性对照孔应呈明显黄色乃至桔红色,阴性和清洗溶液对照孔应接近无色。如上述对照孔成立,则凡深于阴性对照孔色泽的待测样品,均可判断为HBsAg阳性。

    2、比色法:用酶标仪于450nm处,测定各孔OD值。

    【注意事项】

    1、包被是关键的一步,要求包被物纯度高。必要时,包被后用1%小牛血清封闭,以减少非特异性反应。

    2、洗涤要彻底。

    3、结果判断必须在10分钟内完成。

    4、ELISA试剂盒厂家众多,须严格按照试剂盒的说明进行操作。

5、注意自我防护。

 

目录

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生物素-亲和素技术编辑本段回目录

亲和素(avidin)是一种糖蛋白,分子量60kD,每个分子由4个亚基组成,可以和4个生物素分子亲密结合。亲和素可由蛋清中提取,但目前使用较多的是从链霉菌中提取的链菌蛋白(strepavidin)。生物素(biotin)又称维生素H,分子量244.31,存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物,生物素-羟基琥珀亚胺酯(biotin-hydroxysuccinimide,BNHS)可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合,虽不属免疫反应,但特异性强,亲和力大,两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置,可以连接更多的生物素化的分子,形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来,就可大提高ELISA的敏感度。

目前应用的生物素—酶标亲和素系统(biotin-avidin system-ELISA,BAS-ELISA),它是通过生物素标记抗体连接免疫反应系统,同时借助生物素化酶或酶标亲和素引入酶与底物反应系统。

 

BAS-ELISA测定抗HBs

    【原理】BAS—ELISA检测抗-HBs试验采用ELISA间接法结合生物素—亲和素系统试剂,测量血清或血浆中抗-HBs水平。将包被有乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的聚苯乙烯微量反应板各孔分别与病人标本或适当的对照标本一起温育。如果标本中存在抗体,它就与固相抗原起免疫反应。洗去未结合物,加标有生物素的抗人IgG单克隆抗体(B-MAHG),以便形成固相抗原—抗体—第二抗体复合物。洗去未结合的B-MAHG后,孔内加预制的亲和素—生物素化辣根过氧化物酶复合物(ABC)。ABC通过亲和素—生物素桥与抗原—抗体—第二抗体相结合,形成一种含过氧化物酶的固相网。洗去未结合的ABC后,各孔加含有过氧化氢和邻苯二胺(OPD)的底物溶液。经温育后,出现黄色或橙红色,其深度与标本的抗-HBs量相一致。在测量限度内,样品的抗体量越大,则吸光度越高。加酸终止酶反应。对照和标本的吸光度用酶标分光光度计在波长492nm处测量。若标本的吸光度值等于或大于核定的阈值,就认为有抗-HBs反应性。

    【器材与试剂】本试验是以华美生物工程公司试剂盒为主要根据介绍的。该试剂盒包括:

    1、HBsAg溶于含50%甘油的PBS            1小瓶

    2、B-MAHG,溶于含50%甘油的PBS          1小瓶

    3、ABC,溶于含50%甘油的PBS             1小瓶   

    4、阴性对照血清                          3小瓶

    5、阳性对照血清                          1小瓶

    6、OPD结晶                               1小瓶

    7、浓缩的HBsAg稀释剂                    1大瓶

    8、洗涤液                                1大瓶

    9、底物缓冲液                            1大瓶

    10、新生小牛血清                         1大瓶

    11、聚苯乙烯微孔板                       8条共80孔

    【方法】1、包被  将lmlHBsAg稀释剂和9ml蒸馏水吸入一干净试管或烧杯内。将全部 HBsAg溶液移入此容器+缓慢但充分地将三者混匀后,在微板各孔加100μ1混合液。 将微板置于湿盒中,放37℃水浴2h或在4℃过夜。倒去微板中的包被溶液。

    2、封闭  将全部浓缩洗涤液移入一干净烧杯,加490ml蒸馏水,混匀。将烧杯放在37℃水浴2h。所得溶液称“洗涤液”。将5ml HBsAg稀释剂,5ml新生小牛血清和40ml蒸馏水移入一干净烧杯彻底混匀,形成封阻稀释液。各孔加100μ1;封阻稀释液。37℃水浴2h,或在4℃过夜。倒去孔内液体,用洗涤液洗3次。

    3、加样  分别将100μ1阴性(3份)和阳性(1份)对照样品加入选定的反应孔内。吸取100μl待检标本加于各反应孔。将微板置37℃水浴1h。按步骤“2”洗涤3次。

    4、加B-MAGH  将全部B-MAHG溶液移入一干净试管,加10ml封闭稀释液并彻底混匀,各孔加100μ1,置37℃水浴45min,按步骤“2”洗涤3次。

    5、加ABC  将全部ABC溶液移入一干净试管,加10ml封阻稀释液并彻底混匀,各孔加100μ1,置37℃水浴30min,按步骤“2”洗涤3次。   

6、加底物  将5mgOPD溶于10ml底物缓冲液内,加150μ1 3%过氧化氢并彻底混匀,各孔加100μ1,置37℃温育10min。

    7、测定  各孔加100μ1 2mol/L硫酸以终止酶反应。酶标分光光度计用底物空白孔校至零点后,在492nm处测量对照和标本孔的吸光度。

    【结果】将未知标本的净吸光度与阈值作比较,以确定是否存在抗-HBs。阈值是由阴性对照孔吸光度均值(An)与其三倍标准差之和确定的。

    例如:阴性对照样品编号    吸光度

             1                0.050   

             2                0.088

             3                0.076

    An=0.071  0.019

    阈值=An+0.057=0.128

    凡标本的吸光度(As)大于或等于阈值时,被认为具有抗-HBs反应性。若As小于阈值,则认为无抗-HBs反应性。   

    【临床意义】抗-HBs的测定可用来评价受乙肝病毒感染的患者康复和预后;估价HBV疫苗的潜在能力;检查与HBV传播相关的流行病学因素。

    【注意事项】该方法灵敏度较高。在使用中应注意以下几点:

    1、所有试剂均应低温保存。

    2、OPD和ABC应避免暴露在强光之下。

    3、底物缓冲液必须在临用前配制,置于4℃暗处。

4、每次必须作阴、阳性对照。

 

酶免疫组织化学技术编辑本段回目录

   酶免疫组织化学技术(enzyme immunohistochemistry technique)是以酶为标记物检查抗原在组织中的分布或组织抗原的抗体的一种技术。 

酶免疫组化测定EBV-VCA-IgA

【原理】 用带EB病毒壳抗原(VCA)的类淋巴细胞作为抗原靶细胞,将可能含有相应抗体的系列血清与靶细胞一起孵育,洗去未结合的抗体和非特异性成分;再加入酶标记的抗IgA,孵育一定时间后,洗去过量的酶标抗体;最后加入底物,结合上酶标抗体的靶细胞出现底物沉积二着色,即为阳性细胞。

【器材与试剂】1.    试剂盒:B95株靶细胞片、羊抗人IgA-HRP、3,3´-二氨基联苯胺、稀释液、底物缓冲液、阳性对照。

2. PH7.4 0.01 mol/L PBS、3% H2O2、2 mol/L H2SO4

3. 阴性对照血清,待检血清。

4. 湿盒、染色缸、毛细吸管、加样枪、电吹风、显微镜、振荡器等。

【方法】1.     从4℃冰箱中取出靶细胞片,室温吹干。

2.     用PH7.4 0.01 mol/L PBS 将待检血清作1:5、1:10、1:20稀释,滴加于靶细胞片各孔内,最后3孔分别加EB-VCA-IgA阴性、阳性对照血清和PBS(空白对照),所加液体不能溢出小孔。

3.     37℃孵育30min,用PBS轻洗3次(每次5分钟),最后一次洗后室温晾干或用电吹风吹干。

4.     用0.5ml稀释液溶解酶标羊抗人IgA,滴加于各小孔内(约50μl),放入湿盒37℃孵育30min,同上洗涤3次。

5.     将4 mg 3,3´-二氨基联苯胺充分溶于10ml底物缓冲液中,加入新配制的3% H2O2(底物溶液临用前配制)。滴加底物溶液(约50μl)于抗原片上,避光作用10min,使显色。

6.     倾去底物液,蒸馏水洗后吹干,用显微镜观察结果。

7.     若需长时间保存,可将细胞片取出后至于乙醇中浸泡3min 脱水,再滴加中性树胶,加盖玻片封固。

【结果】

阴性:细胞不着色,或呈浅棕的背景颜色。

阳性;细胞呈棕色,在胞膜周围着色较深。

根据显色强度和阳性细胞的数量判定“+”~“4+”。

4+:低倍镜下每视野有100个以上的阳性细胞,呈深棕色;

3+:低倍镜下每视野有数十个阳性细胞,呈棕色;

2+:低倍镜下每视野散布有少数阳性细胞,呈浅咖啡色;

+:在若干低倍视野下可见少数阳性细胞,呈浅咖啡色。

【临床意义】

EB病毒衣壳抗原(EB-VCA)存在于B95胞浆内。若病人血清中查出较高浓度的EBV-VCA-IgA抗体,对鼻咽癌的早期诊断和预后判定有重要的意义。

【注意事项】

1.     试剂盒应在2~10℃冷藏保存,在有效期内使用。

2.     酶标抗体不可反复冻融。

3.     靶细胞片极易受潮或因存放不当而失去活性,故应密封干燥保存。

4.     加样时动作要轻,不要将靶细胞碰掉。

5.     洗涤要彻底。 

免疫荧光技术编辑本段回目录

免疫荧光技术又称荧光抗体技术,是将免疫反应的特异性与荧光技术的敏感性及显微术的精确性相结合的免疫标记技术。以荧光素作为标记物与抗体结合成为荧光抗体,但不影响抗体的免疫学活性。用已知的荧光抗体检测待检标本中的未知抗原,如果彼此相互对应,则在局部形成荧光素标记的抗原抗体复合物。荧光素受到紫外光照射时能发出可见荧光,可借助荧光显微镜观察呈现荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。近年来,免疫荧光技术已有很大改进和发展,已从原来仅限于固定标本,检测组织切片或细胞表面Ag或血清中抗体的定性检测,扩大到进行活细胞分类检测及多种成分的定量检测,因此具有较广泛的用途。

(一)荧光及荧光素
  荧光是指-个分子或原子吸收了给予的能量后,即刻引起发光;停止能量供给,发光亦瞬即停止。荧光素是-种能吸收激发光的光能产生荧光,并能作为染料使用的有机化合物,亦称荧光色素。目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄(FITC)、四乙基罗丹明及四甲基异硫氰酸罗丹明。
   (二) 荧光抗体染色方法
  直接法:这是荧光抗体技术最简单和基本的方法。滴加荧光抗体于待检标本片上,经反应和洗涤后在荧光显微镜下观察。标本中如有相应抗原存在,即与荧光抗体特异结合,在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。此法的优点是简单、特异。但其缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体,且敏感性低于间接法。
  间接法:先将待测抗体(第一抗体)加在含有已知抗原的标本片上作用一定时间,洗去未结合的抗体。然后,滴加标记抗抗体。如果第一步中的抗原抗体已发生结合,此时加入的标记抗抗体就和已固定在抗原上的抗体(一抗)分子结合,形成抗原-抗体-标记抗抗体复合物,并显示特异荧光。此法的优点是敏感性高于直接法,而且无需制备一种荧光素标记的抗球蛋白抗体,就可用于检测同种动物的多种抗原抗体系统。间接法有时易产生非特异性荧光,为其缺点。此法常用于各种自身抗体的检测。 

 

间接免疫荧光法检测抗核抗体

    【原理】间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescence technique)是利用荧光标记第二抗体检测未知抗原或抗体(第一抗体)的方法。现以检测人血清抗核抗体(ANA)为例。ANA是针对自身组织细胞核成分的抗体,无种属、器官特异性。用动物(大、小白鼠)肝切片或有核细胞作为抗原,病人血清中的ANA与细胞核特异性结合,结合的抗体再与荧光标记的抗人免疫球蛋白(或IgG)结合,在荧光显微镜下,细胞核显示荧光,提示血清中ANA的存在。

    【器材与试剂】1、洗片缸、湿盒、吸管、试管、干净的载玻片、盖玻片、标记笔、镊子等。

    2、荧光显微镜、恒温培养箱。

    3、PH8.0 0.Olmol/L磷酸盐缓冲液(PBS),磷酸缓冲甘油(1份PBS+9份甘油)。

    4、荧光(异硫氰酸荧光素)标记羊抗人IgG抗体、丙酮。

    5、新鲜大鼠或小鼠肝脏。

    6、待测血清、阳性对照血清、阴性对照血清。

    【方法】1、制备大白鼠肝印片:取大白鼠肝脏,用生理盐水灌洗后,切成细长条,将切面在载玻片小洞(用蜡笔画的圆圈)内轻轻印压,干后用丙酮在37℃固定15分钟。

    2、于小洞内分别用滴管加待测血清、阴性血清、阳性血清、PBS各1滴(切勿使各血清相互混合),置湿盒内,37℃作用30分钟。

    3、漂洗:取出肝印片用PBS冲洗后,再插入洗片缸内(两张背靠背放),置微型振荡器上,用PBS漂洗3次,每次5分钟。

    4、用滤纸轻轻吸干玻片后,于小洞内各加1滴荧光标记羊抗人IgG抗体,置湿盒内,37℃作用30分钟。

    5、漂洗(操作同上)后,用蒸馏水淋洗一次,于电吹风下吹干(或自然干燥)。

    6、加封载剂(缓冲甘油)于各小洞上,盖上盖玻片(注意避免产生气泡)置荧光显微镜下观察结果。

    【结果】1、一般可以观察到以下四种核荧光染色形态(荧光核型):

    1)周边型(peripheral type)又称粗毛型(shaggy type)或膜型(membranous type),是由抗DNA所产生的核染色,核周围呈荧光光带,而核中央染色弱或无荧光。

    2)均质型(homogenous type)又称弥散型(diffuse type),是由抗核蛋白(抗DNP)所产生的核染色,整个细胞核呈现均匀一致的荧光染色。

3)斑点型(speckled type)由抗可溶性核蛋白(抗ENA)所产生的核染色。核轮廓明显,在核的中央部分染色较浓,呈散布、大小不等荧光斑点。

    4)核仁型(nucleolar type),比较少见,是由抗RNA所产生的核染色,仅核仁着染荧光,呈核内点状荧光染色。

    2、荧光强度分级

    “一”无荧光;“±”荧光微弱可见,“+”荧光可见,“+++”荧光耀眼,“++”介于荧光可见与耀眼之间。

    3、效价

     以荧光强度为“++”的最高稀释度为ANA的效价(或滴度)。

                                                                                                                                                                                              1、核抗原片不宜太厚,否则容易出现非特异性染色。制作肝印片时,肝组织不宜过干,否则印片太厚,但也不宜过湿,影响肝细胞的附着。做好的抗原片应置冰箱干燥保存,否则将影响其抗原性。   

    2、荧光抗体切勿反复冻融。

    3、滴加的血清或荧光抗体,要充分覆盖抗原片,孵育时不可流失,否则将出现假阴性。

    4、染色后应及时观察,片子不宜久置,尤其是光照下,避光一般室温可放置1h或4℃4h。   

    5、本试验需设阳、阴性对照,荧光标记物对照。

    6、核抗原片除可用大(小)鼠肝细胞外,还可用外周血中性粒细胞(应注意可受血型和抗白细胞抗体的干扰)、Hep-2细胞和Hela细胞涂片。鸡红细胞已不常采用,因敏感性差,其中血红蛋白可以熄灭并干扰荧光。

    7、结果观察时,应注意与组织非特异荧光鉴别。后者常大小不等、形态不一、边缘不整齐。

    【附】荧光显微镜

    荧光显微镜根据其光路不同可分为透射光荧光显微镜和落射光荧光显微镜两大类。荧光显微镜组成成像系统的光具组必须无自发荧光特性。

    1、共同特点   

    (1)荧光光源  能发射丰富的紫外光和紫兰光。常用高压汞灯、氙灯、卤钨灯等。高压汞灯的光源中以380、449、600nm波长为主,是较为理想的荧光光源。

    (2)滤光片系统  荧光显微镜的滤光片种类主要有,

    ①吸热滤光片  选择性吸收红外光热辐射线,防止损伤光具组。 

    ②激发滤光片  选择性吸收长波谱线而只通过紫外线、紫色、蓝色和绿色光线,而激发荧光素发出荧光。

    ③阻挡滤光片  选择性吸收短波谱线和红外线而通透较长波可视线,以便观察到荧光并保护眼睛。   

    ④色光分离滤光片  只用于落射光荧光显微镜,可将激发光反射到标本上,使标本发出荧光,再将荧光透射到目镜的滤光反射镜。

    2、透射光荧光显微镜原理。

    激发光束必须通过载物玻片,为了减少激发光线损失,必需使用昂贵的石英载物片和盖玻片。

    3、落射光荧光显微镜原理

    激发光束直接照射在标本上,损失小,荧光效应高。

    4  使用方法:

    (1)将荧光显微镜置暗室,开启光源,待光源稳定并达到一定亮度(约5~10分钟)后,对准光轴。

    (2)装好配对的激发滤光片和吸收滤光片后再作观察,操作同显微镜。

    5、注意事项:

    (1)如用高压汞灯作光源,使用时一经开启不宜中断。断电后需待汞灯冷却后(约15分钟)方能再启动。

   (2)观察标本时间不宜太长,因标本在高压泵灯下照射超过3分钟,即有荧光减弱现象。 

放射免疫技术编辑本段回目录

放射免疫标记技术是将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合,以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法,由于此项技术具有灵敏度高(可检测出毫微克(ng)至微微克(pg),甚至毫微微克(fg)的超微量物质,特异性强(可分辨结构类似的抗原)、重复性强、样品及试剂用量少、测定方法易规范化和自动化等多个优点。因此,在医学及其他生物学科的研究领域和临床实验诊断中广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测定。

(一)放射免疫测定(RIA)
  放射免疫测定(Radio immunoassay,RIA)是1959年Yalow和Berson首先创建的经典放射免疫分析技术,用于血清中胰岛素含量的测定。30多年来,由于此项技术灵敏、特异、并已制成多种标准试剂盒,使用方便,应用范围十分广泛。目前国外已成功地应用RIA检测的物质多达300余种,国内研究的被测物质也达百余种,试制的RIA试剂盒已有60余种,是测定各种微量物质不可缺少的手段。  

(二)免疫放射测定 (IRMA)
  1968年Miles和Hales应用同位素标记的抗胰岛素抗体检测牛血清中胰岛素获得成功,为了区别于经典的放射免疫测定(RIA),他们将其称为免疫放射测定或免疫放射度量分析(IRMA)。由于在反应系统中使用过量的标记抗体,且无竞争性抑制反应,因此抗体与待测抗原达到结合状态的化学平衡,在2-3h即可完成,较少受到抗体亲和常数的限制,即使单克隆抗体的亲和力较低,也能满足试验要求。同时一个抗原分子可以结合多个标记抗体分子,使IRMA的灵敏度明显高于RIA。
  基本原理:IRMA是待测抗原与过量标记抗体的非竞争综合反应,然后加入固相的抗原免疫吸附剂以结合游离的标记抗体,离心除去沉淀,测定上清液中放射性强度.从而推算出检品中抗原含量。
放射免疫法测sIgA

【原理】RIA是标记抗原和未标记抗原对有限量抗体的竞争性结合或竞争性抑制反应。在RIA反应系统中,标记抗原(Ag*)、末标记抗原(Ag)和特异性抗体(Ab)三者同时存在时,由于两种抗原具有相同的决定簇,互相竞争结合抗体的能力相同,结果形成Ag*-Ab和Ag-Ab复合物。
  当Ag*和Ab的量固定时,二者结合形成免疫复合物就受到Ag含量的制约。如反应系统中Ag含量高时,对Ab的竞争结合能力就强,Ag-Ab复合物的形成量就增加,Ag*-Ab复合物则相对减少;反之,当Ag含量低时,对Ab的竞争结合能力弱,Ag*-Ab复合物的形成量即增多。因此,Ag*-Ab复合物的形成量与Ag含量之间呈一定的负相关函数共系。

IgA是血清中含量仅次于IgG的免疫球蛋白,占血清Ig总量的10~20%。血清中IgA主要是单体,占总IgA的85%左右,称为血清型IgA。在唾液、泪液、乳汁、鼻和支气管分泌物、胃肠液。尿液、汗液和阴道分泌物等外分泌液中主要是双体,称为分泌型IgA(sIgA)。IgA和sIgA有共同抗原性,可用同一种RIA方法测定,但分子量不同,需采用各自的标准品。本实验用商品sIgA RIA试剂盒测定唾液中sIgA的含量。
【器材与试剂】1.     放射免疫测定仪、恒温水浴箱、离心机。

2.     sIgA RIA试剂盒:

① 125I-sIgA 一瓶,使用前稀释成1×105cpm/ml;

② 标准品sIgA 6瓶,浓度分别为0、0.25、0.5、1.5和10μg/ml;

③ 抗sIgA抗体一瓶

④ 缓冲液PBS,pH7.4,0.05mol/L;

⑤ 羊抗兔一瓶

⑥ 6.5% 聚乙二醇(PEG),分子量为6000。

【方法】

 按以下步骤进行操作:

 

                0       0.25     0.5     1     5     10      样品管    
 
标准品          0.1     0.1      0.1    0.1   0.1    0.1      —

唾液            -      -       -     -    -     -       0.1

125I-sIgA         0.1     0.1      0.1    0.1   0.1    0.1     0.1

抗sIgA抗体      0.1     0.1      0.1    0.1   0.1    0.1     0.1

 混匀,置37℃水浴1小时
 
羊抗兔二抗体      0.05   0.05   0.05   0.05   0.05   0.05   0.05
 
混匀,置37℃水浴0.5小时后,置于4℃ 10 min
 
5% PEG          0.5    0.5     0.5    0.5    0.5    0.5    0.5 

           混匀,10 min 后 3000rpm 离心15 min,弃上清测沉定放射性。

 

【结果】B/B0

1- B/B0
 
     以标准品含量log 值作横坐标,logit B/B0作纵坐标,绘制log – logit图。

logit B/B0=In       , B为标准管计数率(cpm), B0为零标准管计数率。

    

样品sIgA浓度可从标准曲线上查到,先求出样品管沉淀放射性B,计算logit B/B0,由标准曲线求得相应的sIgA浓度。

【注意事项】注意自我防护及保护环境不受污染。

【临床意义】1.     sIgA的量可作为口服疫苗和免疫治疗效果的评价指标。

2.     反映免疫功能,有广泛的临床诊断价值。 

化学发光免疫分析 编辑本段回目录

化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay,CLIA)是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析。它具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、无污染、仪器简单经济等优点。它是放射性免疫分析与普通酶免疫分析的取代者,是免疫分析重要的发展方向。CLIA发展迅猛,已占各种免疫分析的首位。

化学发光是一种特异的化学反应,有机分子吸收化学能后发生能级跃迁,产生一种高能级的电子激发态不稳定的中间体,当其返回到基态而发出光子,即为化学发光。将化学发光与抗原抗体相结合而形成的免疫分析技术,即为化学发光免疫分析。

化学发光的发光类型通常分为闪光型(flash type)和辉光型(glow type)两种。闪光型发光时间很短,只有零点几秒到几秒。辉光型又称持续型,发光时间从几分钟到几十分钟,或几小时至更久。闪光型的样品必须立即测量,必须配以全自动化的加样及测量仪。测量辉光型的样品可以使用通用型仪器,也可以配有全自动化仪器。

酶标记化学发光法测AFP

【原理】

以 酶标记的抗原或抗体进行免疫反应,免疫复合物上的酶再作用于发光底物,在信号试剂作用下发光,用信号测定仪检测。

【器材与试剂】

1.       固相载体聚苯乙烯珠,抗AFP单克隆抗体

2.     AMPPD

3.     发光增强剂BDMQ

4.     Berthold LB-9501发光仪、微量加样器

【方法】1.       试剂制备

(1)    固相抗体的制备

 聚苯乙烯珠用抗AFP单克隆抗体AFP-9包被。聚苯乙烯珠0.5g/L,置于含有单抗的磷酸缓冲液(50mmol/L)中,室温0.5~2小时。再用含BSA20 g/L的0.1mol/L Tris缓冲液于37℃封闭12~24小时。

(2)酶标抗体制备

胃蛋白酶消化单抗AFP-8,制备抗体Fab′片段,然后用巯基乙胺还原Fab′片段,再用碱性磷酸酶和N-(γ-顺丁烯二酰亚胺丁酰氧酶)琥珀酰亚胺作用,Fab′片段铰链区巯基与碱性磷酸酶顺丁烯亚胺结合,凝胶过滤或离子交换层析纯化。

(3)标准校准     将0.1g/L AFP稀释到1mg/L,每个标准再用标准稀释剂稀释,用EIA和RIA校准标准。

2.   测定

(1)血清样品或标准AFP 10μl 和包被好的塑料珠一枚室温孵育30分钟。

(2)加入酶标抗体37℃37℃。

(3)洗涤后加入AMPPD溶液,反应20分钟。

(4)用Berthold LB-9501发光仪测量5分钟。

(5)计数发光信号以发光单位(RLU)表示,RLU相当于在Berthold 发光仪上每5秒1000计数。

【结果】 以系列标准AFP测得相应RLU,制备标准曲线。将测得样品的RLU在标准曲线上查到AFP含量。 

 

免疫胶体金标记技术编辑本段回目录

免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性,在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中,这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大,称之为免疫金银染色。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法( immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA),用于检测 HBsAg、HCG 和抗双链DNA抗体等,具有简单、快速、准确和无污染等优点。      

胶体金法早早孕实验 

【原理】

胶体金早早孕检测卡用鼠抗α-HCG单克隆抗体和兔抗鼠1gG多克隆抗体分别固相硝酸纤维膜和胶体金标记的抗β-HCG单克隆抗体及其他试剂制成,应用层析式双抗体夹心法的原理检测尿液中HCG,用于妊娠早期辅助诊断.
【器材与试剂】 
  试剂盒由铝袋(内装有一个测试卡、一包干燥剂和一个小吸管)、一个尿杯和一份操作说明书组成。
【方法】

1.使用一次性尿杯或洁净容器收集尿液。任何随意尿液均可适用本检测卡。
  2.除去试剂盒铝箔外包装,用小吸管吸取尿液,加入4滴到测试卡的样品中。
  3.五分钟内观察结果。

【结果】

阳性:在对照区(C)及检测区(T)各出现一条红色线,表示已怀孕;
     弱阳性:检测区(T)的颜色浅于对照区(C)颜色,表示可能刚怀孕。
      阴性:仅在对照区(C)出现一条红色线,表示您未怀孕。
     无效:在检测区(T)及对照区(C)均无红色线出现,或仅在检测区(T)出现红色线,表示   

测试失败或无效。

【注意事项】

1.对照区与检测区均不出现红色线,表明检测错误,应重视。 
  2.若被测者仍怀疑有受孕可能,而尿液测试阴性,可在48-72小时后重新收集晨尿再次测定。
  3.子宫肿瘤、葡萄胎或更年期病人,因尿液中HCG含量较高,可能出现阳性结果。
  4.铝箔复合包装袋内有干燥剂,不得内服。
  5.本产品为一次性使用产品。
  6.本产品只适用于检测尿液。
  7.请勿将尿液直接淋在观察孔中。
  8.产品外包装注明有效期,请在有效期内使用。
  9.使用前请您仔细阅读说明书,严格按说明书操作。
【临床意义】

人绒毛膜促性腺激素(HCG)是受孕妇女体内产生的一种糖蛋白类激素,在受孕妇女血液和尿液中大量存在。卵子受精后第6天开始分泌HCG,一般11天后可以测出,早期妊娠时HCG的分泌量增加很快,约1.7-2天增加一倍,而正常非怀孕妇女尿液检测不到HCG。所以,检测尿液中HCG是判定妊娠的可靠指标。

 

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