免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
应用范围：其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。

一、荧光现象
（一）荧光的产生
　　一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。
　　荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。
　　可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。
（二）荧光效率
　　荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。
　　荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）
　　发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波量接近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。
（三）荧光的猝灭
　　荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。在荧光抗体技术中常用一些非荧的色素物质如亚甲蓝、碱性复红。伊文思蓝或低浓度的过锰酸钾、碘溶液等对标本进行得当复染，以减弱非特异性荧光本质，使特异荧光更突出显示。

荧光物质编辑本段回目录（一）荧光色素
　　许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：
　　1．异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：
　　有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
　　2．四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。结构式如下：
　　最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。
　　3．四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）结构式如下：
　　最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。
（二）其他荧光物质
　　1．酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。
　　2．镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3 ）、铽（Tb3 ）、铈（Ce3 ）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。Eu3 螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。

许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：
（一）荧光色素
1． 异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
2． 四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。结构式如下：最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。
3．四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）结构式如下：最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。

（二）其他荧光物质
1． 酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。
2．镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯合物经
激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用最广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。 所需要的仪器：荧光显微镜、显微荧光分光光度计、流式细胞仪和时间分辨荧光计等仪器 激光共聚焦显微镜

　（一）FITC标记抗体的方法
　　1．Marsshall 氏法
　（1）材料：抗体球蛋白溶液、0.5mol/l pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶（25～50ml）、冰及冰槽（或1000ml烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯（500ml）、pH7.2或8.0的0.01mol/L PBS等。
　　（2）方法及步骤：
　　①抗体的准备：取适量已知球蛋白浓度之溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后蛋白浓度为20mg/ml，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜）5～10min。
　　②荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg 荧光素，用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
　　③结合（或称标记）：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（大约5～10min内加完），加毕后，继续搅拌12～18h。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故须及时添冰去水；亦可将结合装置安放在4℃冰箱或冰库中。
　　④透析：结合完毕后，将球蛋白的溶液离心（2500r/min）20min，除去其中少量之沉淀物，装入透析袋中后再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析（0～4℃）过夜。
　　⑤过柱：取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定）。
洗脱液：0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）;过滤量:12ml标记全球蛋白液(过滤前未透析);收集量:20ml(稀释1.7倍)。
　　分别以1mgFITC溶于2份1mol 0.5mol/L碳酸重碳酸盐缓冲液（分别为pH9.5和pH9.0），于2℃下搅拌将其各加入100mg家兔IgG生理盐水溶液中，搅匀后立即将每份分为两半。一半保留于2℃下，另一半置25℃下。间隔一定时间后各取出0.5ml通过sephadex G-25去游离FITC，由上计算出5mg家兔IgG结合的FITC量。
　　2．Chadwick 氏法
　　（1）材料：抗原球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%重碳酸钠水溶液、0.01mol/l Ph8.0磷酸盐缓冲盐水、1%硫柳汞、离心机及离心管、三角烧瓶（25ml）、冰槽、无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500ml）、透析袋、棉线、玻棒等。
　　（2）方法及步骤：
　　①抗体准备：用0～4℃pH8.0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30～40mg/ml，置入三角烧瓶内，放于冰槽中。
　　②荧光色素准备：按每毫克蛋白加入荧光素0.01mg计算，称取所需之荧光素量，用3%重碳酸钠水溶液溶解。
　　③将准备之抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在0～4℃，冰箱中结合18～24h。
　　④透析和柱层析：方法同Marshall 氏法。
　　3．改良法（1963年） 　根据Marshall 氏法取高价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水（0.15mol/l NaCl）及缓冲液（0.15mol/l NaHCO3 –Na2CO3 PH9.0） 稀释使每毫升内含蛋白10mg,缓冲液为总量的10%，降温至4℃，加入异硫氰酸盐荧光素，（蛋白：荧光素=50～80mg:1mg），在0～4℃下电磁搅拌12～14h。然后用半饱和和硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵（用Nessler氏试剂测验至隔夜透析之盐水无氨离子及荧光色素为止）。将制备好的荧光抗体加叠氮钠0.01%,分装在1ml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中（4℃）可以用半年以上，-20℃保存可达2年以上。
　　【附一】0.01mol/L pH7.2 PBS 配法：NaCl 18g 、Na2HPO41.5g、KH2PO40.2g,溶于2000ml蒸馏水中，校定pH至7.2。
　　【附二】0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液配法：取0.5mol/l Na2CO3(5.3%)10ml加入0.5mol/l NaHCO3(4.2%)90ml,混合后，校定pH至9.0。
　　【附三】3%重碳酸钠水溶液配法：称1.5g无水重碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。
　　4．透析标记法　　 此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。
　　（1）用0.025mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0，将欲标记免疫球蛋白稀释成1%浓度，装入透析袋中。
　　（2）用同一缓冲液将FITC配成0.1mg/ml的溶液，按1%球蛋白液体积的10倍，将FITC稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于FITC液中。容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在4℃电磁搅拌下，透析标记24h。取出透析袋中标记液，即刻用sephadex G-50 凝胶过滤，去除游离荧光素，分装、贮存于4℃中。

　　（二）四乙基罗达明标记抗体方法
　　取1g RB200及PCL52g放在乳钵中研磨5min（在通风橱中）。然后加入10ml无水丙酮，放置5min，不断搅拌。过滤，用滤液进行标记抗体。剩余部分吸附在滤纸上，4℃干燥保存。
取抗体（20mg/ml）每毫升加入生理盐水和0.5mol/l pH9.0的碳酸盐缓冲液各1ml稀释。逐滴加入0.1ml RB200溶液，边加入边搅拌，在0～4℃中结合12～18h，再用生理盐水透析5～7h，经葡聚糖凝胶G-50柱层析，除去游离荧光素，分装，贮存于4℃备用。

　　（三）四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法
　　（1）Igg 10ml (6mg/ml)在0.01mol/l pH9.5碳酸盐缓冲液中透析过夜。
　　（2）将四甲基异硫近氰酸罗达明（每毫克IgG加入5～20μg）溶于二甲亚砜（1mg/ml）,取此溶液300μl，一滴一滴加入蛋白质溶液中，同时电磁搅拌。
　　（3）在室温中搅拌2h，避光。
　　（4）把结合物移入直径3cm,高30cm大小的Bio –Gel P-6层析柱（用0.01mol/l pH8.0的PBS平衡过），流速为1.5ml/min。
（5）收集先流出的红色结合物，即为标记抗体，分装，4℃保存备用。

　　（四）藻红蛋白标记抗体的方法
　　1．巯基化藻红蛋白（phycoerthrin PE）的制备，600μl的15.5mg/ml盐酸巯醇亚胺（iminothiolane hydrochloride）加到1.2ml的3.6mg/ml的PE中，和1.2ml PB、pH6.8 混合，装入透析袋置入50mmol/l pH6.8 PB中透析，4℃过夜，再换用pH7.5PB透析6h。每个PE分子中可结合8个巯基。
2．PE-IgG制备　　异双功能试剂SPDP[n - Succ - inimdyl 3-(2-pyridyldlthio) propinate ] 30μl (1.1mg/ml)的乙醇溶液，加入700μl的4.2mg/ml IgG PB溶液（50mmol/l pH7.5），在室温中反应2.5h。再加入巯基化Pe 400μl（1.7mg/ml）加到500μl反应混合液中，室温反应12h，加入100μl的50mmol/L碘乙酸钠封闭残余巯基，用PB透析过夜，4℃。加入0.01%Na3N3分装，4℃保存半年。

　　（五）PE-标记蛋白A方法
　　（1）取4.08mg PE溶于0.1mol/l pH7.4PB（含0.1mol/l NaCl）1ml中，溶解后，取出0.5ml，再加入10μlSPDP无水甲醇液（2.65mg/ml）,SPDP/蛋白摩尔比为10，22℃反应5min，过Sephadex G-50(1×17cm),用100mmol/l pH7.4 PBS（含0.1mol/l NaCl）平衡和洗脱。
　　（2）0.5ml蛋白（2mg/ml）100mmol/l PB(含有100mmol/l NaCl) pH7.4，加入2.6μl上述SPDP甲醇液，SPDP：蛋白=9.5,22℃,40min ,加入25μmol/L二硫苏糖醇（DTT）pH7.4缓冲液，22℃，25min，同上过Sephadex G-50，收集蛋白A峰。
　　（3）取0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合，22℃反应6h，混合物4℃保存备用。
以上两种PE标记制品，可最后溶于0.01mol/l pH7.4PB(含有0.1mol/l DETA、1mol/L碘乙酰胺、1%BSA 和0.1%NaN3),0～5℃保存。

　　（六）蓝色荧光素标记抗体方法
　　Kbaffan等（1986）首先创立了蓝色荧光素标记和染色技术，可进行双标记或多标记。
　　（1）取7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methyl coumarin, AMC）260μg溶于二甲亚砜25μl中。
　　（2）将上液加入10ml IgG的 巴比妥缓冲液（0.5mol/L,pH8.5,内含50～100mg IgG）中，室温反应2h，过Sephadex G-50除去游离荧光素。
　　AMC呈黄色结晶固体，最大吸收波长354nm,最大荧光波长430nm。

(一)　原理
目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。

(二)　操作步骤
　　　　将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，
　　　　透析后抗体液移入小烧杯中
　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO)
　　　　使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO
　　　　FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFITC／mgIgG；
　　　　如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG
　　　　在10ml小烧杯中先放入抗体
　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中
　　　　　　　　　　　↓
　　　　将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h
　　　　　　　　　　　↓
　　　　用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G25柱
　　　　　　　　　　　↓
　　　　收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P
　　　　比值。第二个荧光素峰为游离荧光素
　　　　计算:
　　　　　　　　　2.87×A495
　　　　F／P＝────────
　　　　　　　　A280-0.35×A495
　　　　合适的F／P值为2～4。

(三)　试剂器材
　　1.纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。
　　2.FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。
　　3.PBS、DMSO
　　4.PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na2CO34.3g，NaHCO3 8.6g加蒸馏水至500ml。
5.PD10柱(Sephadex G25柱)
6.拌器，紫外分光光度计等

(四)　注意事项
　　1.　FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。
　　2.　FITC-DMSO液要临用时配制。
　　3.　碳酸盐缓冲液要新鲜配制。

（一）免疫球蛋白的提取
（二） 荧光素
1． 荧光色素的基本条件
（1）  具有化学活性基团，如异硫氰基（-NCS）等，易与免疫球蛋白结合形成共价键。
（2） 对免疫球蛋白无毒性，不影响抗体活性。
（3） 荧光效应高，与蛋白结合需要量少。
（4） 荧光素性能稳定，结合物性能稳定，容易贮藏。
（5） 结合物的颜色必须与背景组织有良好的反衬作用，易于观察判定。
    到目前为止，基本符合上述要求的荧光素只有异硫氰酸荧光素（FITC），丽丝胺罗丹明B200（RB200）。
2．常用的荧光色素
（1）异硫氰酸荧光素 ：又称异硫氰酸荧光黄，纯品为橙黄色粉末。分有结晶型与粉末型两种,结晶型荧光强度大、稳定、优于粉末型。分子式C21H11O2N5、分子量389，溶于水，易溶于pH8-9.5碳酸盐缓冲液中。最大吸收波长为495nm。最大发射波长520nm。异硫氰酸荧光黄性质稳定，于低温下可保存二年以上，但久置标记抗体能力弱，荧光亮度差，故应采用新产品。
异硫氰酸荧光素借助异硫氰基与蛋白中氨基酸（主要是赖氨酸）的氨基结合。一个IgG分子有86个氨基酸残基，一般最多能标记16～20个荧光素分子。
（2）丽丝胺罗丹明：为褐色粉末，不溶于水、易溶于酒精和丙酮。荧光为桔红色。性质稳定，可长期保存。分子式C23H29O7NaS2，分子量为580，最大吸收波长570nm，最大发射波长为600nm。
由于丽丝胺罗丹明荧光效能较低，一般不单独使用，多用于与FITC标记抗体的反衬染色或双标记配合使用。此染料不能直接与蛋白质结合，必须先用五氯化磷（PCl5）处理，使染料的-SO3Na基变为-SO3Cl基后，才能在碱性条件下与赖氨酸的氨基结合，形成稳定的硫氨键。
（三） 标记方法
异硫氰酸荧光素常用的标记法有以下两种：
1． 搅拌法
（1）取一定量的纯IgG液，用0.5Mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液稀释至20mg/ml。
（2）按荧光素与蛋白质比1︰20～1︰100（一般用1︰100）称取异硫氰酸荧光素，用pH9.5碳酸盐缓冲液溶解。
（3）将球蛋白液置于电磁搅拌器上，启动开关，轻轻搅拌，以不起沫为准。逐滴加入荧光素液（约10min～15min加完）。加完后，随时用试纸测定搅拌液的pH值，若低于9.0，则应以碳酸钠溶液调整。置4℃搅拌6h～12h即可。
2． 透析法
（1）将IgG液以0.5Mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液稀释成1%浓度，装入透析袋中。
（2）将荧光素配成0.1mg/ml，其量为1%蛋白液的10倍，装入烧杯中。
（3）将透析袋置于烧杯中，放电磁搅拌器上4℃搅拌24即可。
透析法的优点是标记均匀，非特异性荧光少，但所标记的时间长，荧光素的用量多，约比搅拌法多10倍。
3．影响标记的因素
（1）荧光素与蛋白质的比值：这也取决于荧光素的质量与保存期。一般而言，粉末状荧光素以0.025mg/mg～0.05mg/mg蛋白质为宜，而结晶型则只需0.006mg/mg～0.008mg/mg蛋白质即可。
蛋白含量以20mg～25mg/ml为宜，浓度过低标记过慢。浓度过高，标记效果不好。不过在实践中，以稍高一些蛋白浓度为好。
（2）pH值：以pH9.0～9.5为最好。过低标记速度慢，过高蛋白质容易变性。
（3）温度和时间：温度4℃～25℃均可。温度与时间是成正比的，温度低，反应慢，温度高，反应快。4℃需要6h～12h，7℃～9℃需要3h～4h，20℃～25℃只需要1h～2h。实践中可自选。透析法还是以4℃较长时间反应为好。
（4）荧光素的质量及有效期。
（四）标记抗体的纯化
标记后溶液是一个混合体，它包括蛋白质与荧光素的结合体，还有游离的荧光素、游离的蛋白质以及结合过多的蛋白质。对于某些细菌性的诊断荧光抗体，则只要去除游离的荧光素即可。对于一般组织染色荧光抗体，则要去除过度标记的抗体即可。只是对某些特殊要求的组织染色试剂，则必须经过仔细的处理，包括具有特异性交叉反应或非特异性反应性的除去。
1． 去除游离的荧光素
（1）透析法：将标记好的抗体放入透析袋中于0.01Mol/L pH7.6 PBS中或生理盐水中4℃透析数天，每天换液数次，直至透析液中无游离色素为止。通常约需5～7天才能透析完毕。
（2）凝胶过滤：以G25或G50葡聚糖凝胶装柱进行过滤。次法速度快，一般1h～2 h即可完成。也可以先透析4h～5h，让大部分游离荧光素除去，再过G25或G50柱。
2． 去除过度标记的蛋白质分子  可采用DEAE—纤维素过柱法。利用阶梯洗脱法进行，具体方法如下：
（1）以0.01Mol/L pH 7.6 PB液洗脱。
（2）以0.01 Mol/L pH 7.6 PBS液（0.05Mol/L NaCl）洗脱。
（3）以0.01 Mol/L pH7.6 PBS（0.1Mol/L NaCl）洗脱。
（4）以0.01 Mol/L PH 7.6PBS（0.2Mol/L NaCl）洗脱。
收集每部分有荧光抗体的洗脱液管，于495nm测荧光素的OD值，再于280nm测蛋白的OD值，查标准曲线，算出各管荧光素和蛋白质的浓度，并计算出F/P比值（见后介绍），将合格者合并，浓缩后分装小瓶备用。
 层析柱上滞留的过度标记的蛋白质，可用1 Mol/L 的NaCl洗脱。
3．去除交叉反应等非特异性染色因素  非特异性染色的干扰因素，包括免疫血清的不纯、类属抗原以及荧光色素的质量不高、标本处理不当等。可以以脏粉进行吸收。具体做法如下：于每ml标记抗体中加入脏器干粉（脏粉制法见附录）100mg，充分混合，于室温中振荡约1 h，然后以10 000 r/min离心30min，吸取标记抗体。必要时可减半脏粉用量再处理一次。
经过脏粉吸收后的荧光抗体必须加0.1%叠氮钠防腐（注意不能加硫柳汞，因为重金属对荧光素有影响）。分装小瓶冷冻保存。
（五）标记抗体的鉴定
1．F/P比值鉴定  荧光色素与球蛋白的结合率即为F/P比值。分别制备荧光色素与蛋白质的标准曲线。
异硫氰酸荧光素的标准曲线是以0.5Mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液分别配成0.25μg/ml、0.5μg/ml.、0.75μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml……10.0 μg/ml的浓度，在495nm波长测其OD值，按重量与OD值在坐标上制成标准曲线。
蛋白的标准曲线是将牛血清蛋白分别配成0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.4 mg/ml…1.6mg/ml，在280nm测其OD值，并绘制成曲线。按以下公式计算F/P比值：
              1．6× 104          FITCμg/ml              FITCμg/ml
F/P（克分子比值）=           ×               =0.41 ×
                390         抗体mg/ml             抗体mg/ml           
式中1•6×104为抗体蛋白质的分子量，390为异硫氰酸荧光素分子量。
F/P克分子比值以1～2为合适，1～3.5为合格。比值过低敏感性差，比值过高，易出现非特异性反应。用于检查组织细胞抗原成分，F/P以1～2为好；用于检查细菌涂片时，F/P以2～3为好。
2． 免疫电泳测定  通过免疫电泳可以测定荧光抗体的免疫纯度。要求在球蛋白的部位上只出现一条沉淀线。
3．染色性能的鉴定  包括测定荧光抗体的敏感性与特异性。
（1）荧光抗体效价的测定：将荧光抗体倍比稀释，然后用已知抗原制片，分别用各稀释度去染色，观察“++”荧光强度的最大稀释倍数即为该荧光抗体的染色滴度（或单位）。实际应用时则取2个或3个单位做应用的稀释度。
（2）荧光抗体的特异性试验：为了确保荧光抗体的特异性，必须预先进行下列试验。①阳性标本染色试验：即用所制荧光抗体去染色已知的相应的抗原，结果应是阳性；②阴性标本染色试验：即用所制荧光抗体去染色已知的非相应抗原，结果应是阴性；③类属性抗原染色试验：取与已知抗原相近的类属抗原（如炭疽杆菌与枯草杆菌或类炭疽杆菌等），用荧光抗体染色，应为阴性，说明特异性强，如不同程度地出现有荧光，说明具有类属反应，特异性不强等；④抗体吸收试验：以过量的相应抗原加入荧光抗体中，感作2h~4h，4℃过夜，离心取上清再对相应抗原染色，应无荧光或荧光显著消退；⑤染色阻抑试验：用未标记的抗体对相应抗原进行染色，冲洗后，再用荧光抗体对相应抗原进行染色，结果观察，应无荧光。阻抑试验应注意抗体与抗原的相应比例，未标记抗体的比例过小，结果抗原结合有剩余，标记抗体仍能被结合而显示出阻抑不全。当抗体比例过大，则抗体的一个结合点结合而表现出不牢固，极易被标记抗体所置换出来而又显示出阻抑不全。

（一）制片
选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。
（二）固定
除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。
标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。
表   常用抗原物质的固定方法
抗原物质             固定剂  固定条件（min）
蛋白质抗原  95%～100%乙醇  室温3～10
酶、激素  丙  酮  4℃  30
免疫球蛋白  四氯化碳 
病    毒  丙酮、四氯化碳、无水乙醇  室温5～10或4℃  30～60    
多糖、细菌等     微火加热，甲醇、10%甲醛、丙酮  室温5～10或4℃ 30～60
类    脂     （异嗜性抗原）   10%甲醛，10%佛茂尔（ForMol）  室温3～10
（三）水洗
固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。
（四）染色
染色分直接染色法与间接染色法。
1． 材料与试剂
（1）荧光抗体，稀释至应用浓度。
（2）0.01Mol/L pH7.4PBS液
（3）9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。
（4）带盖方盘
2．直接染色法
（1）将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37℃感做30 min～45min。
（2）PBS冲洗3次，每次冲洗3min，即3×3ˊ冲洗。
（3）蒸馏水冲洗。
（4）滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。
2． 间接染色法
（1）  检查抗原：①取固定标本，加已知的免疫血清，37℃孵育30min；②以PBS液3×3ˊ冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37℃孵育30min；④PBS 3×3ˊ冲洗；⑤H2O冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。
（2） 检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，甲醇固定；②滴加相应抗原液（按1﹕100～1﹕500稀释），37℃孵育30min；③PBS液3×3ˊ冲洗；④加荧光抗体，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ冲洗；⑥水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。

（一）结果显示
荧光显微镜所观察到的图象，主要以两个指标判断结果，一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者结合起来，综合判定。
 荧光强度的表示方法如下：
 ＋＋＋ ～ ＋＋＋＋：荧光闪亮，呈明显的亮绿色。
 ＋＋              ：荧光明亮，呈黄绿色。
 ＋                ：荧光较弱，但清楚可见。
 ±                ：极弱的可疑荧光。
 －                ：无荧光。
（二）标本保存
由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。
 保存的方法可采取以下几种：①固定标本片以后低温保存，随用随染；②染色片采取优质封固剂，如特别的荧光封固剂（Fluormount）或碱性优质纯甘油固剂等封固。这些封固剂能防止荧光激发，封固后低温保存；④可以采用拍照保存照片。

　　对制备的荧光抗体必须进行质量鉴定，主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。
　　（一）染色特异性和敏感性的测定
　　1．特异性染色效价的测定　　直接染色以倍比稀释荧光抗体溶液如1：2，1：4，1：8……，与相应抗原标本作一系列染色，荧光强度在“+++”的最大释释度，即为该荧光抗体的染色滴度（效价）或单位。实际染色应用时，可取低一个或两个稀释度（即2～4个单位），如染色效价为1：64，实际应用时可取1：32或1：16。间接染色效价可按抗核抗体荧光染色法步骤，先用不同稀释度的荧光抗体染色，结果以抗核抗体荧光强度“++”为标准，染色用效价和直接法相同。
　　2．非特异性染色测定　　根据荧光抗体的用途不同，可用相类似的抗原切片或涂片，倍比稀释荧光抗体，按常规染色，结果在标本上出现的非特异染色应显著低于特异染色滴度，否则应采取消除非特异性染色的方法处理荧光抗体。
　　3．吸收试验　　在荧光抗体中加入过量相应抗原，于室温中搅拌2h后，移入4℃中过夜，3000r/min,离心30min，收集上清液，再用以染相应抗原阳性标本，结果应不出现明显阳性荧光。
　　4．抑制试验如前述。
　　（二）F/P比值的测定
　　F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量，一般要求F/P的克分子比值为1～2。过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱，降低敏感性。
　　1．蛋白质定量 　　测定荧光抗体的蛋白质mg/ml量。
　　2．结合荧光素定量 　先制作荧光素定量标准曲线，即准确称取FITC1mg,溶于10ml 0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液中，再用0.01mol/l pH7.2PBS稀释到100ml，此时荧光素含量为10 μg/ml，以此为原液，再倍比稀释9个不同浓度的溶液，用分光光度计在490nm波长测定光密度值（OD），以光密度为纵坐标，荧光素含量为横坐标，作标准函数图。
　　荧光素与蛋白质结合后，其吸收光谱峰值向长波方向位移约5nm,FITC和蛋白质结合后由490nm变为493～495nm，RB200和蛋白质结合后变为595nm。
　　四、荧光抗体的保存
　　以0～4℃或-20℃低温保存，防止抗体活性降低和蛋白变性。最好加入浓度为1：5000～10000的硫柳汞或1：1000～5000的叠氮钠防腐，小量分装如0.1～1ml，真空干燥后更易长期保存。
免疫荧光细胞组织化学技术注意事项编辑本段回目录1.荧光染色注意事项
(1)染色反应最好在湿盒内进行,以免标本上试剂干燥.染色试剂的干燥是造成非特异性染色反应的原因之一.
(2)染色反应的酸碱度以接近体液环境为宜(PH=7.4左右),因此,切片冲洗液及抗体稀释液均应注意酸碱度的调整.
(3)组织细胞要求新鲜,最好使用冷冻切片,固定存档标本要求组织结构完好.
(4)切片经染色后,应及时观察并照相,不宜长期保存,以免褪色.切片在4度冰箱内过夜,其荧光强度将减弱约30%.
(5)抗体稀释度以获得最佳染色效果,背景非特异性染色最小为标准,因此对每一批抗体必须试验摸索,找出最佳稀释度.
(6)为防止抗体效果下降,所购抗体应及早试验,并应尽量减少抗体溶液的冻融次数.
(7)若非特异性染色过强时,在染色反应前应先将荧光抗体离心,去除沉淀物后再使用.
(8)缓冲甘油的配制方法:取纯甘油20ml,加入0.5ml/L PH9.5碳酸缓冲溶液20ml,充分混匀. 
2.荧光显微镜标本制作要求
(1)载玻片:载玻片厚度应在0.8--1.2mm之间.太后的玻片,一方面吸光太多,另一方面不能使激发光在标本上聚焦.载玻片必须光洁,厚度均匀,无明显自发荧光.一般无需用荧光载玻片.
 (2)盖玻片:盖玻片厚度在0.17mm左右,光洁.为了加强激发光,也可以用干涉盖玻片.这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质(如氟化镁)的盖玻片,它可以使荧光顺利透过,而反射激发光,这种反射的激发光又可以激发标本.
(3)标本:组织切片或其他标本不能太厚,如太厚激发光大部分消耗在标本下部,而物镜直接观察到的上部为充分激发.另外,细胞组织重叠或杂质掩盖影响判断.
(4)镜油:一般暗视野荧光显微镜和镜油观察标本时,必须使用镜油.最好使用特制的无荧光的镜油,也可用缓冲甘油代替.液体石蜡也可用,只是折光率较低,对图像质量略有影响.

3.使用荧光显微镜注意事项
(1)应在暗室中进行检查,进入暗室后,接上电源,点燃超高压红灯5---15mins,待光源发生强光稳定后,眼睛完全适应暗室,再开始观察标本.
(2)防止紫外线对眼睛的损伤.在调整光源时应戴上防护眼镜.
(3)检查时间以每次1--2h为宜,超过90mins,超高压汞灯发光强度逐渐下降,荧光减弱,标本受紫外光照射15mins后,荧光也明显减弱.所以最多不得超过2---3h.
(4)荧光显微镜光源寿命有限,标本应集中检查,以节省时间,保护光源.灯熄灭后欲再使用时,须待灯泡充分冷却后才能点燃.1天中应避免数次点燃光源.

4.荧光图像的记录方法
  荧光显微镜所看到的荧光图像,一是具有形态学特征,二是具有荧光的颜色和亮度.在判断结果时,必须将二者结合起来判断.结果记录根据效果指标,即凭工作者目力观察,作为一般定性观察,基本上是可靠的.随着科学技术的发展,在不同程度上采用客观指标记录判断结果,如用细胞分光光度计,图像分析仪等仪器.但这些仪器记录的结果,也必须结合主观的判断. 
5.荧光抗体的保存
保存荧光抗体一要防止抗体失活,二是防止荧光素不脱落和不受激发猝灭.一般认为0--4度可保存1--2年,-20度可保存3--4年.宜小量分装,禁止反复冻融.保存前需加防腐剂(一般加入浓度1:5000--1:10000的硫柳汞或1:1000--1:5000叠氮钠防腐)和除菌.真空干燥后更易长期保存. 
6.荧光亮度的判断标准
一般分四级,"-"------无或可见微弱荧光,"+"-----仅见明确可见的荧光,"++"------可见明亮的荧光,"+++"------可见耀眼的荧光

一、标本制作
可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定，作免疫荧光染色用。

二、荧光抗体染色方法
　　（一）直接法
　　1．染色 切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如1：8或1：16的荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等），在室温或37℃染色30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。
　　2．洗片 　倾去存留的荧光抗体，将切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗两次，搅拌，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。
　　3．用50%缓冲（0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0～9.5）甘油封固、镜检
　　4．对照染色
　　①正常免荧光血清染色，如上法处理切片，结果应为阴性。②染色抑制试验（一步法）：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替未标记抗血清，染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。③类属抗原染色试验，前面已作叙述。
　　直接法比较简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。
　　（二）间接法
　　（1）切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。
　　（2）再滴加间接荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色30min，37℃，缓冲盐水洗两次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。
　　对照染色：①抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。②抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。③阳性对照。
　　间接法中上述方法称双层法（Double Layer Method）。另一种称夹心法，即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下：
　　①切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。
　　②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃，30min。
　　③缓冲盐水洗2次，每次5min，吹干。
　　④滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃，30min。
　　⑤如③水洗。
　　⑥缓冲甘油封固，镜检。
　　间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原，敏感性较高，操作方法较易掌握，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的研究和检查，所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。
　　（三）补体法
　　1．材料
　　（1）免疫血清60℃灭活20min，用Kolmers 盐水作2倍稀释成1：2，1：4，1：8……。补体用1：10稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价，如为1：32则免疫血清应作1：8稀释。
　　（2）补体用新鲜豚鼠血清一般作1：10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按2单位的比例，用Kolmers盐水稀释备用。Kolmers盐水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲盐水中，溶解MgSO4的含量为0.01%浓度。
　　（3）抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为1：4，补体为2单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价1：4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。
　　2．方法步骤
　　（1）涂片或切片固定。
　　（2）吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液（此时免疫血清及补体又都稀释一倍）滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定湿度的染色盒内。
　　（3）用缓冲盐水洗2次，搅拌，每次5min，吸干标本周围水液。
　　（4）滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体30min，37℃，水洗同（3）。
　　（5）蒸馏水洗1min，缓冲甘油封固。
　　3．对照染色
　　（1）抗原对照。
　　（2）抗血清对照：用正常兔血清代替免疫血清。
　　（3）灭活补体对照：将补体经56℃30min处理后，按补体同样比例稀释，与免疫血清等量混合后，进行补体法染色。
　　本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制，因而一种荧光抗体可作更广泛的应用，敏感性亦较间接法高，效价低的免疫血清亦可应用，节　省免疫血清，尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。
　　（四）膜抗原荧光抗体染色法
　　本法应用直接法或间接法的原理和步骤，可对活细胞在试管内进行染色，常用于T和B细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原和受体等的检查和研究，阳性荧光主要在细胞膜上。FACS即采用此法原理。
　　（五）双重染色法
　　在同一标本上有两个抗原需要同时显示（如A抗原和B抗原），A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用罗达明标记，可采用以下染色方法：
　　1．一步法双染色　 先将两种标记抗体按适当比例混合（A+B），按直接法进行染色。
　　2．二步法双染色 先用RB200标记的B抗体染色，不必洗去，再用FITC标记的A抗体染色，按间接法进行。
　　结果：A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现桔红色荧光。
　　（六）荧光抗体再染色法
　　若切片或其他标本经某种荧光抗体染色后，未获得阳性结果，而又疑有另外的病原体存在时，可用相应的荧光抗体再染色。
有时存档蜡块不能再用以切片，也可用存档的HE染色标本，褪去盖片和颜色，再作免疫荧光或其它免疫细胞化学的染色。

三、荧光抗原染色法
　　某些抗原可以用荧光素标记，制成荧光抗原，标记荧光素的方法与制备荧光抗体方法相同。用荧光抗原可以直接检查细胞或组织内的相应抗体，特异性较好，敏感性较差。染色方法同荧光抗体染色的直接法。由于多数抗原难以提纯或量少不昂贵，一般很少采用此法。

非特异性染色的主要因素

　　组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：
　　（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。
　　（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。
　　（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。
　　（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。
　　（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。
（6）荧光素不纯，标本固定不当等。 

　　消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：
　　（一）动物脏器粉末吸收法
　　常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。
　　肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。
　　用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2～3次，12000r/min 10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。
　　【肝粉的制法】
　　（1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水洗2～3次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。
　　（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。
　　（3）将肝匀浆装入离心管内（1/3左右），交换地用2～3倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用2000r/min离心沉淀15min后，再除去上清液。
　　（4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。
　　（5）在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。
　　（二）透析法
　　荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。
　　（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。
　　（2）浸入0.02mol/ph 7.1～7.4的PBS中（悬于大于标记物体积约50～100倍的PBS内），在4℃中透析，每日更换3～4次PBS，约5～7天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。
　　（三）葡聚糖凝胶G-50柱层析法
　　除游离荧光素可用2×46cm柱层析法，详细方法参阅第二章　。加入荧光抗体15～18ml（按床体积的5%～10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30～40min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测F/P比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用20%磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。
　　若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，NH4+太浓，在蛋白未完全洗脱时即出现NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集，之后出现SO4++（用1%BaCl2检查发生白色沉淀）。最后是NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无SO4++及NH4+后可再用。
　　如仅用小量荧光抗体，可用1×20cm的柱层析柱，取2g Sephadex G-50装柱，即可过滤2～3.5ml荧光抗体。
　　（四）DEAE纤维素柱层析法
　　标记过多或过少荧光素的抗体分子可用DEAE-纤维素柱层析法除去。方法如下：
　　DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯IgG方法相同。装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20～50mg标记蛋白量为宜。常用梯度洗脱法如下：
　　（1）层析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，标记物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘3），然后依下列各种离子强度洗脱液，分别洗脱和收集：
　　0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/l NaCl）……洗脱部分1。
　　0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/l NaCl）……洗脱部分2。
　　0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/l NaCl）……洗脱部分3。
　　将此三部分收集液（每管5ml）分别测定其F/P比值，0.05mol/l NaCl pH7.2PB洗脱液280nm光密度高峰管合并，浓缩保存备用。因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。其他两部分可以废弃。
　　（2）柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加NaCl的浓度至2.0mol/L洗脱完。
　　经过DEAE-纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失50%，因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。
　　（五）荧光抗体稀释法
　　先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。
　　（六）纯化抗原法
　　用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。近代免疫化学技术（免疫吸收法）和柱层析法等提供了很大的可能性，可参考有关专著。
　　（七）纯化抗体法---免疫吸收法
　　例如抗IgA血清的纯化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（SIgA）抗原纯度不高，所制的抗血清常与IgG呈交叉反应，为此需要吸收，常采用纯化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收纯化。方法如下：
　　1．人IgG聚合物的制备　　在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/l pH7.0磷酸缓冲溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，边加边搅，5min即出现混浊，逐现大块胶块，放置30min后，用研钵将凝胶磨细，继用1.0mol/l pH7.0磷酸缓冲溶液反复洗涤3次，末次加蒸馏水至20ml，即为人IgG聚合物悬液。
　　2．免疫吸收法　　将待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物悬液，置室温搅拌60min,离心沉淀，上清液即稀释1倍的纯化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
　　（八）伊文氏蓝（Evans blue）衬染法
　　用0.01%伊文氏蓝的0.01mol/l pH7.2PBS稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。伊文氏蓝一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀释至0.01%用以和然释荧光抗体。
　　此外，还可以用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色，提高特异性染色。

（一）材料与试剂
1．病毒株  牛流行热（BEF）北京毒株。
2．实验动物  无牛流行热的小公犊牛、健康雄性家兔。
3．被检血清。
（二）操作方法
1．特异性阳性血清的制备  以BEF强毒脱纤血给小公犊牛静脉接种10ml，出现典型症状后两周，以同样剂量做第二次接种，以后每隔一周接种一次，共5～6次，剂量分别为15ml、20ml、25ml、35ml，末次接种后2周采血清样品测效价，效价达1︰128以上时即可放血收集血清，-20℃保存。
3． 荧光抗体的制备与鉴定
（1）健康牛血清IgG的提取  取牛血清以30%饱和（NH4）2SO4提取3次，然后以少量PBS溶解沉淀，4℃透析18h，过G25柱，以0.005Mol/L pH7.2PBS液洗脱，收集洗脱液，再透析18h，以0.01Mol/L pH7.2PBS平衡4h，离心去沉淀，过DEAE纤维素柱，收集IgG，测其蛋白含量和纯度。
（2）兔抗牛血清IgG高免血清的制备  取健康家兔数只，免疫前一周分别于足掌部接种卡介苗1ml（含2mg）两侧各接种0.5ml。
牛IgG加弗氏完全佐剂乳化后，分四点（两前肢掌部及后肢股内侧皮下）各注射0.5ml，每只兔为2ml，共注射6次，每次间隔1周，第5次与第6次间隔2周。6次含IgG及卡介苗的量分别为3.4mg、4.0mg、5.2mg、7.6mg、11mg、22mg和6.6mg、5.0mg、8.0mg、7.6mg、8.8mg、10mg。
琼扩法测血清抗体效价1︰64~1︰128为合格。
（3）兔抗牛IgG高免血清IgG的制备  同提纯健康牛血清IgG法。
（4）荧光抗体的标记及鉴定  按兔抗牛血清IgG量的1/50称取异硫氰酸荧光黄，将荧光素溶于IgG溶液总量的1/10体积的0.5Mol/L pH9.6碳酸缓冲液中，再缓慢滴加在磁力搅拌器下的IgG溶液中，于18℃～20℃搅拌3h，然后将荧光抗体结合物立即通过葡聚糖凝胶G25柱，以0.005Mol/L pH7.2PBS洗脱，收集第一峰，求出F/P比值，以F/P值为2左右（各批平均比值）合格。
将荧光抗体分装于安瓶中、封口、并置 -40℃保存。
3．抗原标本片的制备  将BEF病毒接种于BHK21细胞，当CPE达70%～90%以上时，将细胞刮取下来，以1 000r/min离心5min，去上清，加入灭菌盐水，再离心5min，以沉淀的染毒细胞作抗原标本涂片，自然干燥后，丙酮（室温）固定10min，PBS液洗一次，再用去离子水洗一次，吹干，即可染色，不染色的抗原标本置4℃保存。以同样方法把未接毒的细胞制成抗原对照标本片。
4．染色方法  取制备的抗原标本片及对照标本片，将经生理盐水作10倍稀释的特异性阳性血清、阴性血清分别滴加在抗原标本和对照标本上，置湿盒37℃温育30min～45min。以0.01Mol/L pH7.2PBS洗3次，每次3min，再用无离子水冲洗一次，吹干。以0.2%伊文斯兰稀释成1︰16～1︰32的荧光抗体滴加于抗原标本上，置湿盒37℃温育30min～45min，然后按上法处理吹干，以碳酸缓冲甘油封表。
（三） 结果判定
于荧光显微镜下观察，阳性结果：细胞膜呈明亮的黄绿色荧光，细胞核呈棕褐色，背景呈暗褐色；阴性结果：不出现荧光。

（一）材料与试剂
1．猪瘟荧光抗体  由指定单位购买，按说明书稀释使用。
2．0.01Mol/L pH7.2PBS液 
3．缓冲甘油  优级纯甘油9份和碳酸盐缓冲液1份混合而成。
4．碳酸盐缓冲液：
0.5Mol/L 碳酸钠       1份
0.5Mol/L 碳酸氢钠     3份
混合即可。
5．荧光显微镜
6．冰冻切片机
（二）操作方法
1．组织切片制作  取新鲜的扁桃体与肾组织块，用冰冻切片机制成5μm~7μm原冰冻组织切片，粘于清洁的载玻片上（0.8 mm ~1.0mm），空气中自然干燥后，立刻在室温下放入纯丙酮固定15min，取出后PBS液轻轻漂洗数次，自然干燥后染色。如不能及时染色，可用塑料纸包好，放入低温冰箱中保存。
2．荧光抗体染色   滴加猪瘟荧光抗体（工作浓度）2~3滴，以覆盖为度，放入湿盒中，37℃感作30min（切忌染色液干涸）。以PBS液3×3min冲洗。
3．染色片半干时，滴加缓冲甘油封片，置荧光显微镜下观察。
4．对照的设置  将组织切片固定后，滴加猪瘟高免血清，37℃感作30min，冲洗后，以猪瘟荧光抗体染色。
（三）结果判定
将染色好的组织片置激发光为蓝紫光或紫外光的荧光显微镜下观察。
阳性结果：扁桃体隐窝上皮细胞或肾曲小管上皮细胞的胞浆内呈明亮的翠绿色荧光，细胞形态清晰。
阴性结果：无荧光或荧光微弱，细胞形态不清晰。

试验材料：
（1）抗原片：家鼠型和姬鼠型汉坦病毒标准毒株感染Vero E6或Vero细胞制备，低温干燥保存；
（2）阳、阴性对照：单克隆抗体或确诊阳性患者恢复期血清（阳性对照）、阴性血清；
（3）羊抗人（或兔抗人）IgG荧光抗体；
（4）常用稀释液：pH7.2～7.4PBS、伊文思兰等；
（5）荧光显微镜。
检测步骤：
（1）用pH7.4，0.02mol/L PBS稀释待检血清，从1:20开始做2倍或4倍连续稀释至需要的稀释度。
（2）取出抗原片，用蒸馏水漂洗后，冷风吹干。
（3）用加样器依次从高稀释度到低稀释度逐个加入已稀释的待检血清，加入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期血清，下排为恢复期血清），在37℃水浴箱湿盒孵育30～40分钟（每次试验同时设阳、阴性对照）。
（4）用PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，再用蒸馏水洗涤1次脱盐，冷风吹干。
（5）用含1：3万的伊文思兰PBS按工作浓度稀释荧光结合物，滴加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在37 ℃水浴箱湿盒孵育30分钟，然后同（4）洗涤、漂洗、吹干。
（6）荧光显微镜观察结果。
结果判断：
细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。根据特异性荧光颗粒多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例，可将免疫荧光反应大致区分为1～4个“+”。
可参考阳性细胞数：<25%为“+”，25%～50%为“++”，51%～75%为“+++”，>75%为“++++”；无特异性荧光者为“—”（阴性）。
检测抗体滴度时，以能观察到明显特异性荧光反应（>“+”）最高血清稀释度的倒数表示。
意义：
阳性结果，表明曾受到汉坦病毒感染，>1：20有诊断参考意义；
恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高则可确诊。

G 免疫荧光实验举例：免疫荧光法检测鼠肺抗原
材料：
（1）鼠肺；
（2）荧光素标记抗汉坦病毒单克隆抗体
（3）荧光显微镜。
方法：
（1）组织片制备：冷冻切片机切片，吹干，冷丙酮固定10分钟，PBS冲洗2次，蒸馏水漂洗1次，吹干，-20℃保存备用；
（2）组织片吹干，滴加荧光素标记单克隆抗体，设两孔对照，分别加荧光素标记的非汉坦病毒单克隆抗体和PBS，置湿盒内37℃水浴30分钟；
（3）取出，用PBS冲洗3次，蒸馏水漂洗1次，吹干；
（4）荧光显微镜观察结果。
结果判断：
特异性免疫荧光呈黄绿色颗粒，分布在鼠肺上皮细胞胞浆中，正常组织细胞呈橙红色或暗红。
意义：阳性结果，说明宿主动物带毒。