免疫细胞化学或称免疫组织化学（Immunochistochemistry）是通过特异的抗原、抗体反应标记上可见的显示物系统来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。此方法可以识别定位各种细胞组织成分，发现蛋白质、多肽、核酸、部分类酯、多糖、激素、病原体（寄生虫、细菌病毒）、受体、神经介质、肿瘤的标记物（抗原或相关抗原）等，一般认为凡具有抗原性或半抗原性物质都可以用免疫细胞化学方法检查并显示出来。在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察其性质定位，还可以利用细胞分光光度计、图像分析仪、共聚焦显微镜等进行细胞原位定量测定。例如，在肿瘤学研究中，免疫组织化学方法是一种把分子水平的物质准确具体表达出来的一种方法，这些分子水平的物质可能与癌细胞，细菌，病毒等等有关。自从成功地制作出这些特异性的抗体，使组织结构可以从分子水平中显示出来，这些特异性抗体可以与肿瘤细胞中特定的结构结合，这些抗体被称为单克隆抗体。把这些单克隆抗体孵育在组织切片上，与特定的靶细胞进行特异的反应。如单克隆抗体可以与癌细胞发生特异性反应，单克隆抗体可以从特定的肿瘤病人血细胞中获得。在组织切片中结合的抗体可以用棕色或红色显示出来。比如，对转移到骨组织中的肿瘤细胞进行标记实验，我们可以用前列腺特异性抗体进行标记，如显示出棕色或红色的阳性反应，我们可以明确地判断这个转移性肿瘤来自前列腺癌，有些转移的肿瘤距原发部位可能更远。免疫组织化学不仅能帮助准确地诊断出肿瘤的性质，还可以预测肿瘤预后的生物学行为。例如，我们可以知道所有组织细胞的增殖活性。这不是更有意义的实验吗？我们能够判定在一种肿瘤组织中，80%的细胞增殖抑制了其他10%的肿瘤细胞的增殖，我们可以判定出这种肿瘤细胞增殖率高，要比其他肿瘤生长迅速，进展快。在其他方面，免疫组织化学染色可以指导某些肿瘤的化疗，如：可以测定女性乳腺癌细胞中携带雌激素受体的含量。如果癌细胞中雌激素表达阳性，病人可以进行三苯氧胺的治疗，雌激素能够促进乳腺癌细胞的生长，三苯氧胺有封闭癌细胞中雌激素受体的功能。在此过程中，携带雌激素受体的癌细胞是通过激素促进它生长的，而且，癌细胞增生可以通过三苯氧胺治疗来阻止其生长的。因此，免疫组织化学测定雌激素受体的表达情况，可以预测三苯氧胺治疗的意义。这仅仅是免疫组织化学应用中的一个小例子。免疫组织化学在确定组织起源中的应用前景是无限的。免疫组化技术是一个复杂的生物技术，对每一个抗体标记物都有独自特定的染色方法，目的是能够明确各种组织起源，判定组织中是否存在特异抗原。癌症病人就诊时，外科医生会在肿瘤部位取一小块组织，送给病理科医生。在病理科，送检的组织经过石蜡包埋，制作成非常薄的组织切片，切片再进行HE染色，然后病理科医生将切片放在显微镜下观察，观察送检的标本中有没有肿瘤细胞，并做出诊断是患何种肿瘤。不幸的是，许多肿瘤组织细胞在显微镜下看起来非常相似，以致于病理医生难以完全准确地判断出肿瘤的性质。在许多肿瘤病例中，鉴别诊断是非常困难的，因为只有明确了肿瘤的性质，医生才能针对每种肿瘤制定出最有效的治疗方案，目前已经从分子水平研究出肿瘤细胞的表面和细胞内有特异性的物质表达。过去在传统的光学显微镜下及电镜下所看到的组织切片中的结构，曾经幻想的分子水平的结构，已经有现代免疫组织化学技术证明，这个技术的整个过程就叫做免疫组织化学方法。

CD抗原

CD，即分化丛（clusters of differentiation）。第Ⅳ届国际免疫学会议命名委员会（1983，京都），根据T细胞表面的分化抗原存在丛集现象，将这种抗原命名为CD抗原。CD抗原不仅存在于T细胞，也存在于B细胞，巨噬细胞等。

指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生的原因有以下几个方面：
1． 抗原特异性。指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子，必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。
2． 共同决定簇。即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。
3． 决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。
• 抗原决定簇。它是指在抗原分子上为免疫系统识别和作用的基团，是抗原的关键结构。抗原决定簇的种类有1016?/FONT>1018种之多。决定簇的数目称为决定簇的价数，较大的分子决定簇较多，如红细胞上的A或B血型抗原，其决定簇数目可能超过100万。
• 多抗和单抗特性比较
1. 均一性。一种单抗中，每个抗体的化学结构和氨基酸顺序都相同，只有一种Ig亚类。即单抗是一种纯度很高的均一抗体。而从不同动物，不同时期所得到的多抗，各有不同的化学组成。多抗是多种种类和亚类Ig的混合物。
2. 稳定性。单抗的稳定较差，对PH变化敏感，对热不稳定，提纯过程中易变性，而多抗的稳定性则较好。
3. 特异性。单抗是单一地针对抗原的某一决定簇，所以用它进行血清学反应时，特异性强，敏感性高，一般不发生交叉反应。而多抗能与抗原上的多种抗原决定簇结合，所以特异性较差，较易引起交叉反应。
4. 重复性。单抗的重复性好，而多抗每批都不一样。

多抗由于与抗原多价结合容易形成网络样沉淀，而单抗只与抗原结合产生二聚体，不能直接形成抗原抗体沉淀物。
抗体的保存
抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100Mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。
绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。
被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。
保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。
病理科成立免疫组化室需要哪些小设备（仪器）
1． 冰箱（4℃、-18℃）：贮存免疫试剂用。
2． 18cm不锈钢高压锅+电炉或家用微波炉。（抗原修复用）
3． 孵育盒（有机材料）；不锈钢或塑料耐高温切片架。
4． 冲洗瓶两个，定时器一个，10ml玻璃试管五个，塑料试管架。
5． 1000ul国产移液器两支，200ul进口移液器一支，20ul进口移液器一支，相应吸嘴。
6．磨砂玻片。
7. PAP油笔。

（一） 免疫荧光细胞化学技术
1941年，浣熊等建立了免疫荧光细胞化学技术，它的原理是根据抗原抗体反应的规律，把已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗原或抗体，然后以它作为探针来检测组织或细胞内的相应物质。应用的方法有直接法、间接法、夹心法和补体法等。在荧光显微镜下，根据其形成复合物所发的荧光，来确定判断检测物的来源、性质和部位。目前，免疫荧光细胞化学技术已经广泛地应用于许多研究领域，如免疫学、微生物学、病理学和临床检验学等。
由于免疫荧光细胞化学技术所具有的特异性、快速性和某方面的准确性，又由于许多新技术和仪器的应用如激光技术、电子计算机、扫描电镜和双光子显微镜、荧光激活细胞分类器等，该项技术可发展至更高的阶段，开创更新的领域。虽然如此，应用于临床作为病理学的诊断还是少之又少，相信随着各种技术的提高，在不久的将来，将会有更多的荧光抗体被应用于临床的诊断。

（1）常用的抗体和蛋白质标记的荧光素有：
①异硫氰酸荧光黄（Fluoresein isothiocyanate，FITC）：结晶粉末状，呈黄色、橙黄色或褐黄色，易溶于水和酒精等溶剂，室温下可保存两年以上，最大发射光谱为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。
②四甲基异硫氰酸罗达明（Tetramethylyodamine isothiocyanate，TRITC）：结晶粉末状，呈紫红色，易溶于水和酒精等溶剂。最大发射光谱为620nm，呈现橙红色荧光。
③四乙基罗达明（Tetramethylyodamine B200，RB200）：结晶粉末状，呈褐红色，易溶于酒精和丙酮，但不溶于水。最大发射光谱为596～600nm，呈现橙红色荧光。

（2）常用的荧光标记法
①直接法：这是最早的方法。其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体，染色时将该抗体直接滴在载玻片上进行孵育，使之直接与载玻片上的抗原结合，于荧光显微镜下观察检查，作出判断。
评价：该法简单易行、特异性高、快速方便，常用于肾活检几种免疫球蛋白的检测和病原体的检测。但其存在不足就是只能检测相应的一种物质，敏感性较差，效果有时不理想，目前较少作为更多方面的检测。
②间接法：该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后，继用间接荧光抗体，与前面的抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下，根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。
评价：本法由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。目前本法应用较广泛，只需制备一种种属荧光抗体，即可适用于多种第一抗体的标记显示。
1.存在问题：
2.制作好的切片不能长期保存，影响各种资料的积累。
3.所作出的结论较主观。
有些经固定的石蜡切片不适合等。

（二）免疫酶细胞化学技术
这种技术的基本原理是通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，在检测时，抗原抗体复合物中带有标记结合上去的酶，其特性可催化底物，在抗原抗体反应的部位上产生不溶性的有色产物，从而可用一般光镜来检测判断，确定组织的来源、种属和部位。
评价：
1.优点：
2.可用光镜检查。
3.切片可长期保存，有利于资料积累。
4.可以会诊，所得结果较为客观。
5.既适用于冰冻切片，也适用于石蜡切片。
技术较为简单，易于普及和推广。
1.存在问题：
2.酶与抗体间的共价结合可损害部分抗体和酶的化学。
3.酶标记抗体分子量较大，对组织的穿透性较缓慢。
4. 抗血清中的非特异性抗体被酶标记后与切片中的抗原结合，常可引起背景的染色，影响阳性物的判断。
敏感性不强，目前已不被使用。

（三）非标记抗体酶法
由于酶标抗体存在许多问题，1974年Strernberger等人建立了非标记抗体酶法，其中最具代表的方法是过氧化物酶法即PAP法。
奶头法的染色原理：应用第二抗体即桥抗体将抗原抗体结合后的复合物与PAP复合物连接起来，形成较大的复合物，利用复合物中HRP（）水解底物而呈色。
PAP由3个过氧化物酶分子和2个抗过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，较为稳定。
评价：PAP法自建立起至二十世纪九十年代初期被应用，它在当时来说具有较高的敏感性，有人认为它比酶桥法灵敏度高出20倍左右，有人则认为它的灵敏度与放射免疫法相似。
1.存在问题：
2.第一抗体和第三抗体必须为同种种属动物。如第一抗为小鼠的，则第三抗体就一定要用小鼠的。
3.抗体孵育时间过长。第一抗体的孵育时要求放于4℃冰箱中过夜，时间可达十几小时。长时间的孵育可产生几种不良后果：一是容易产生背景染色；二是影响染色的成功率，常可导致切片脱离载玻片等。
4.复合物分子较大，移动缓慢，对组织的渗透力不强。
5.可产生背景染色，影响阳性结果。
6.整个过程需时过长，约20小时。
阳性物不明显不突出。

（四）亲和组织化学法
由于其它方法存在许多问题，1981年Hsu等创立了美国广播公司法（抗生素蛋白－维生素H－peroxidase复杂的技术），它的原理是利用卵白素分别连接生物素标记的第二抗体和生物标记的酶，由酶催化底物，生成终产物，于抗原抗体活性部位沉淀下来。卵白素是一种糖蛋白，在鸡蛋白中被发现，分子量为68000，它与生物素有4个连接部位。据认为卵白素和生物素的亲和力要比抗原和抗体的亲和力高出百万倍，因而它们能够牢固地结合，又不影响它们间的生物活性。
评价：美国广播公司法自1981年创立至今已有二十多年的时间，在各种技术高速发展的今天，这种技术能被较长时间的使用，说明它有着极强的生命力和实用性，这是因为它有着以下主要特点：
1.敏感性强，卵白素与生物有4个连接部位，据认为它比PAP法敏感性更高，高出约20-40倍。
2.需时少，节省大量的时间。如PAP法的一抗孵育时间于4℃冰箱中需十几小时以上，而本法一抗孵育时间在1-60分钟以内。
3.背景清晰，阳性物鲜艳易辨。
4. 抗体可被高度稀释，增加标记病例，降低成本。
存在的问题：
1. 需要预先形成复合物，即卵白素和生物素，在加于切片前的30分钟，先将两者混合起来，形成复合物。该复合物为三维结构，在结合了其它物质后，就会使自身体积增大，行动缓慢，活动受限。
2.卵白素中含有约7%的糖类，它可与组织中含糖基的物质起反应，造成背景的染色。
3.卵白素的等电点约10左右，可带较多的负电荷 ，纤维组织可带较多的正电荷，这两种电荷可互相吸引，造成背景的染色。
4.卵白素中有4个结合点，其中一半与连接抗体结合，另一半与复合物结合，如此可降低其敏感性。

（五）碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法（APAAP，Alkaline phosphatase anti alkaline phosphatase）
1984年Cordellt Massen氏等人创立了APAAP法，该法的基本原理是在加入一抗后，依靠二抗的桥作用，将抗原抗体复合物和APAAP复合物连接起来，然后通过复合物中的磷酸酶对底物的水解，生成鲜红色或蓝色的产物。（鲜红色一般底物采用的是偶氮染料快红（fast red ）或者蓝色快蓝色（fast blue）。
评价：在其它许多方法中，如ABC法和PAP法等，应用的显色剂都是3.3二氨基联苯胺（3,3，diaminobenzidine, DAB），据认为，该试剂有致癌作用，（现已认为它已没有致癌性作用），为了避免使用上述试剂，因而创立了这种方法。它敏感性高，不受组织中内源性过氧化物酶的影响和干扰，可产生出鲜艳的红色或蓝色阳性物，非常容易被鉴别，常被用作双标。
存在问题：
1.切片不能长期保存。因为显色用的是快红或快蓝，这些染料后着染色后的颜色，不能经过酒精的脱水处理，一浸入酒精，所着染的颜色将被全部脱掉。只能用水性胶封片，然该种封片法保存的切片时间不长，一般只有数月即会褪色。
2.切片的透明度较差，不到于拍摄极佳的照片。

（六）免疫金银法（Immunoglold-sliver staining, IGSS）
1978年Geoghegan等首次应用免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原。1981年Danscher在此基础上改进并发展了用银显影液增强光镜下金颗粒可见性的IGSS。
基本原理：通过免疫反应，沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化作用，用对苯二酚将银离子还原或银原子，被还原的银原子沉积在金颗粒周围形成“银克”。它本身具有催化作用，使更多的银离子还原并促进“银壳”越长越大，最终在光镜下就能看到被放大的黑褐色物质。
评价：该法敏感性高，特异性强，据认为它比PAP法高20倍左右，背景较低，阳性物易辨性好，可用于任何切片，能检测微量的抗原。
存在问题:
1.操作繁锁，步骤较多。
2.需要预先制备成胶体金。
3.需要在暗室中进行。
4. 由于使用的金-银试剂，容易造成沉淀或污染。

（七）LSAB法，(Labeled streptavidin biotin) 或者SP法（Streptavidin）
ABC法虽然是一种很好的方法，但是在实际的应用过程中，确实也存在着许多问题，为了解决和克服存在的问题，90年代初提出了用链卵蛋白素（streptavidin）替代ABC法中的卵白素生物素复合物。该物质是从链菌属蛋白中分离出来的一种蛋白，有四个和生物素亲和力极高的结合点。
评价：LSAB法是目前国内使用最广泛的一种方法，由于它的敏感性强，效果好，背景清晰，无杂质而大受人们的欢迎。其优点有：
1.不需预先形成复合物，分子体积小，行动灵活，对组织参透性强。
2.链卵蛋白素的等电点为5.5-6.7，接近中性，所带的负电荷少，不容易与组织中的正电荷发生相互吸引，因而可降低背景的染色。
3.链卵蛋白素不含糖基，不存在与组织中含糖基类的物质起反应的现象。
4.链卵蛋白素有4个与生物素结合的点，它们可以全部地和2抗上的生物素结合，从而增加其敏感性，从某种意义上讲，它比ABC法的敏感性起码增加一倍以上。
5.节省时间，每种抗体的孵育时间都在10-30分钟左右。
6.抗体可以高度稀释，增加标记病例，降低成本。
7.背景清晰，无非特异性染色，阳性物突出，明显易辨。
8.染色时间短，提高了染色的成功率，经几千例的实验证明，染色成功率几近100%，减少了反复制作的机会，保证了病理报告的及时发出，为病人的治疗和诊断赢得了时间。

（八）EnVision TM Systems
该法是近几年在国内推广使用的一种方法，它的原理是将多个抗鼠和抗兔诉IgG分子与辣要过氧物酶聚合，当形成复合物后，可直接与抗原抗体的复合物聚合在一起，经DAB显色即可完成染色。
评价：
1.该法敏感性更高，效果更好。
2.步骤减少，省时省力。
3.抗体的孵育时间可节省。
4.该系统不含有生物素，可以免除由内源性生物素所造成的背景染色。
5.背景清晰干净，阳性物突出明显。

（九）真空负压LSAB法
该法创立于1992年，几经实验证明，该法效果好，质量高，能节省很多时间，并获得军队科技进步3等奖。其基本原理是：
各种物质的分子在真空负压的条件下，由于失重而飘游起来，从而增加了各物质分子间的碰撞机会，加速了抗原抗体的结合，使反应提前完成。
特点：
1.省时，全过程由过去的十几小时缩短为1-1.5小时，为患者获得更多的时间。
2. 抗体可高度稀释，可达厂家推荐的稀释度高1-2倍，增加标记的病例，降低成本。
3.不需要用酶消化，简化了步骤；保证了染色的成功率，减少了返工的现象，节省了人力物力。
4.全部过程不需加温，减少摸索温度的麻烦，条件易控制。
5.不受其它条件的限制，每次可大量染片，多至百余张。
6.阳性反应物颜色鲜艳，色彩迷人，背景清晰，无非特异性染色，结果易判断。

免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。

免疫荧光细胞化学分直接法、夹心法、间接法和补体法。
一、直接法
1．检查抗原法 这是最早的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。此法很特异和简便，但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。
2．检查抗体法 将抗原标记上荧光素，即为荧光抗原，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体定位检测出来。
二、间接法
1．检查抗体法（夹心法）　　此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。
2．检查抗体法　　用已知抗原细胞或组织标本的切片，加上待检血清 ，如果其中含有切片中某种抗原的抗体，抗体便沉淀结合在抗原上， 再用间接荧光抗体（抗种属特异性IgG荧光抗体）与结合在抗原上的抗体反应（如检测人血清中的抗体必需用抗人IgG荧光抗体等），在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异性荧光 。此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。
3．检查抗原法双薄片　　此法是直接法的重要改进，先用特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（或称第一抗体）与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（也称第二抗体，种特异性）与结合在抗原上的抗体（是第二抗体的抗原）结合，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗全显著多于直接法，从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合3～5个分子抗体，当此抗体作为抗原时又可结合3～5分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强3至4倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显示。这是现在最广泛应用的技术。
三、补体法
1．直接检查组织内免疫复合物法　　用抗补体C3等荧光抗体直接作用组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，而形成抗原抗体补体复合物---抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物的存在处，此法常用于肾穿刺组织活检诊断等。
2．间接检查组织内抗原法　　常将新鲜补体与第一抗体混合同时加在抗原标本切片上，经37℃孵育后，如发生抗原补体抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原抗体—抗补体荧光抗体的复合物，此法优点是只需一种荧光抗体可适用于各种不同种属来源的第一抗体的标记显示。
四、双重免疫荧光标记法
在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时，要进行双重荧光染色，一般均采用直接法，将两种荧光抗体（如抗A和抗B）以适当比例混合，加在标本上孵育后， 按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TMRITC或RB200标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原的定位。
五、对照试验
为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次试验时进行以上对照试验：
1．直接法  需设下述对照试验
（1）标本自发荧光对照：标本只加PBS或不加PBS，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察应呈阴性荧光（无与特异性荧光相似的荧光）。
（2）抑制试验：可分为二步法和一步法。
①二步抑制法：标本先加未标记的特异性抗体，再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。
②一步抑制法：先将荧光抗体用未标记抗体作适量混合，再加在标本上染色，结果应为阴性。此法效果较二步法好，并且简便。
（3）阳性对照：用已知阳性标本作直接法免疫荧光染色，结果应呈阳性荧光 。
如对照（1）和（2）无荧光或弱荧光，（3）和待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。
2．间接法
（1）自发荧光对照：同上（一）。
（2）荧光抗体对照：标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。
（3）抑制试验：同上。
（4）阳性对照：同上。
如对照（1）、（2）、（3）均呈阴性，阳性对照和待检标本阳性则为特异性荧光。
3．补体法
（1）自发荧光对照
（2）荧光抗体对照
（3）抑制试验
（4）补体对照：取新鲜豚鼠血清1：10稀释先作用标本，再用抗补体荧光抗体染色，结果阴性。
（5）抑制试验：标本加灭活的第一抗体，再用1：10稀释度的新鲜豚鼠血清孵育后，再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀 释液，结果应为阴性。
（6）阳性对照：（1）～（5）结果阴性，（6）和待检标本阳性时，则为特异性荧光。

1． 诊断敏感性。指患者中因此试验得到阳性结果的百分率。计算方法：TP/（TP+FN）χ100%。理想试验的诊断敏感性为100%。
2． 诊断特异性。指正常人与无关疾病的患者中因此试验得到阴性结果的百分率。非患者的阴性结果为真阴性，其阳性结果为假阳性。计算方法：TN/（TN+FP）χ100%。理想试验的诊断特异性应为100%。
3． 诊断指数。为评价某种试验敏感性与特异性的综合指标。理想的指数应为200%，≤100%的试验不能成立。
4． 诊断效率。某种试验能准确区分患者和非患者的能力。计算方法：（TP+TN）/（TP+FP+TN+FN）×100%。理想试验的诊断效率应为100%。
5． 阳性预测值。指在所有阳性结果的人中，非患者的百分率，计算方法：TP/（TP+FP）×100%。理想试验的阳性预测值应为100%。
6． 阴性预测值。指在所有阴性结果的人中，非患者的百分率，计算方法：TN/（TN+FN）×100%。理想试验的阴性预测值应为100%。

　　一、免疫荧光法

　　免疫荧光细胞化学是利用荧光色素标记抗体与组织切片或细胞涂片中的相应抗原反应，形成抗原与标记抗体的复合物，借助紫外光或蓝紫光激发荧光色素；在显微镜下呈现特异性荧光反应，从而定位抗原的技术。
　　1．免疫荧光染色原理

　　免疫荧光染色是根据抗原抗体反应原理，将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，再与其相对应的抗原或抗体起反应，从而使形成的免疫复合物上带有一定量的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，检测出抗原或抗体，并进行定位及定量。最常用的荧光素是异硫氰酸荧光素(fluorescien isothiocyanate，FITC)。

　　2．染色方法

    (1）直接法 用荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原结合，检查出相应的抗原成分。

    操作方法 ①冷冻切片、涂片、印片或细胞培养物按要求固定，石蜡切片按常规脱蜡至水。②用PBS(pH值7.4)充分水洗标本。③滴加相应的荧光抗体，将标本放入湿盒中，在室温或37℃染色30min，倾去作用液。④用PBS洗2次，每次5min。蒸馏水洗1min。⑤用50％甘油缓冲液封片。镜检查。

    对照染色：可作阴性、阳性、抑制法等对照试验。

    2．间接法

    此法是将荧光素标记到第二抗体上。先使第一抗体作用于组织切片与抗原反应，用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再与荧光素标记的抗体（第二抗体）作用。在荧光显微镜下观察，发荧光部位即未知抗原所在处。此法较直接法敏感性高，且只需标记一种抗IgG抗体即可鉴定多种抗原。

    操作方法：冰冻切片或涂片用甲醇、乙醇或丙酮固定，石蜡切片按常规处理。→以PBS充分冲洗→滴入未标记的第一抗体液，将标本放入湿盒中，在37℃作用30min，倾去作用液→以PBS洗2次，每次5min→滴加荧光抗体（第二抗体），将标本放入湿盒中，在37℃作用30min，倾去作用液。→以PBS洗2次，每次5min→缓冲甘油封片，镜检。

    3．补体法 用特异性抗体和补体的混合液与标本上的抗原反应，补体就结合在抗原—抗体复合物上，再用抗补体的荧光抗体与补体结合，从而形成抗原—抗体—补体—抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下见到阳性荧光的抗原。

    操作方法：标本处理与直接法相同→滴加适当稀释的抗体及补体等量混合滴于切片上，将标本放入湿盒中37℃放置30min →用PBS洗2次，每次5min，搅拌或振动，吹干→滴加适当稀释的抗体，在37℃中染色30min→用PBS洗2次，每次5min，振动，蒸馏水洗1min →甘油缓冲液封固。

    对照染色，可作正常血清替代试验，灭活补体对照，即补体经56℃30min灭活处理后，按补体同样稀释倍数与抗体等量混合，进行补体法染色。结果均应为阴性。

    二、免疫酶细胞化学

  (一)免疫酶染色原理

    免疫细胞化学是以酶为标记物，其原理与免疫荧光法基本相似，可分为直接法、间接法、补体法、免疫酶桥法、免疫酶双桥法、过氧化物酶抗氧化酶法（PAP）和双PAP法等。最常用仍是辣根过氧化物酶，其次是碱性磷酸酶等。

  (二)染色方法

1．  直接法

 　　（1）其原理是用酶标记的特异性抗体直接与标本中的相应抗原反应结合，再与酶的底物作用产生有色的产物，沉积在抗原—抗体反应部位，即可对抗原进行定性、定位以至定量研究。直接法简便、快速，特异性强，非特异性背景反应低。   

　　（2）染色方法

    1)切片按常规处理后在PBS液中洗5min。

    2)用稀释的正常血清或10mg的牛血清白蛋白溶液处理切片20min，倾去蛋白质溶液。

    3)滴加酶标记抗体(适当稀释)于切片上，在湿盒中，37℃孵育30—60min。

    4)PBS洗涤2次，每次5min，再用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液洗涤5min。

　　5)在酶的底物溶液中呈色反应，显微镜下观察，以结果清晰、背景无非特异性染色为度，根据供氢体不同，可分别作衬染、封固。

2．间接法

   （1）原理是先用未标记的特异性抗体（一抗）与标本中相应抗原反应，再用抗特异性抗体的酶标记抗体与结合在抗原上的一抗反应。可用一种酶标记抗体与多种一抗配合检查多种抗原。

    (2）染色方法

    1)与直接法(1)中(2)相同。

    2)滴加稀释的特异性抗体（如兔免疫血清）于标本上，4℃过夜，或在室温中30～60min。

    3)PBS洗涤2次，每次5min，振动。

    4)滴加酶标记抗体（适当稀释的羊抗兔IgG HRP标记抗体）于标本上，室温孵育30min。

    5)以后同直接法。

3．酶桥法

   （1）酶桥法的原理是用化学交联法将酶与抗体分子连接，染色时在用特异性抗体与标本中抗原结合之后，将桥抗体结合于其上，再将抗酶抗体结合于桥抗体上，最后把酶结合在酶抗体上，经过底物的呈色反应而将抗原显示出来。   

（2）染色方法

    1)组织切片脱蜡至水，PBS洗3次。

    2)过氧化氢——甲醇（30％H2021m1加甲醇100m1）在室温中处理切片5～30min。

  3)充分水洗后，入PBS洗2次，每次5min。

    4)用20倍稀释的正常血清（产生二抗的动物血清）在室温下反应30min。

    5)用PBS洗2次，每次5min。

    6)第一抗体（用兔产生的），在4℃下反应16～24h。

    7)PBS洗2次，每次5min。

    8)第二抗体（羊抗兔IgG血清），在室温下反应30min～1h，用PBS洗2次，每次5min。

  9)兔抗酶抗体在室温下反应30min～1h，用PBS洗2次，每次5min。

  10)用过氧化物酶溶液（70～100μgPBS溶解）在室温中作用30min，PBS充分洗净。

    11)在DAB—H2O2液中进行呈色反应5～30min，充分水洗。

    12)可用苏木素液淡染细胞核。

    13)乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

4．过氧化物酶抗过氧化物法(PAP)法

   （1）过氧化物酶法的原理  PAP法的基本原理与酶桥法相同，只是酶和抗体制成的免疫复合物（PAP）代替了酶桥法中的抗酶抗体和随后结合的酶。

     （2）染色方法

    1)石蜡切片经二甲苯脱蜡，经下行各级酒精水化；冰冻切片置空气干燥，丙酮固定20～30min；

载有培养细胞的盖片或细跑涂片经戊二醛、酒精或多聚甲醛固定5min。

    2)切片经PBS冲洗3次，每次5min.

    3)用甲醇+0.3%H202（现用现配）。处理切片30min（室温），以封闭内源性过氧化物酶。

    4)PBS冲洗3次，每次5min。

    5)1:20的正常羊血清室温孵育30min，以封闭非特异性结合位点。

    6)用滤纸吸去羊血清(勿干)。

    7)滴加稀释一抗，湿盒内4℃孵育过夜。

    8)PBS冲洗3次，每次5min。

    9)滴加二抗，湿盒内孵育45min～60min。

    10)PBS冲洗3次，每次5min。

    11)滴加PAP复合物，湿盒内37℃孵育45 min～60min。

    12)PBS冲洗3次，每次5min。

    13)DAB—H202液显色。

    显色可以滴染或浸染，随时镜检，至显色满意时用PBS中止显色。必要时用苏木精复染细胞核。

    14)脱水，透明，封固。

   三、免疫金—银细胞化学

    1971年，由Faulk和aylor创立的免疫金染色方法使胶体金技术作为标记物首次应用于免疫组化研究，1983年将免疫金法与银显影方法相结合，创造了一种灵敏度更高的免疫金—银染色法，这种方法还可用于核酸的原位杂交研究中，使得胶体金标记技术在免疫电镜和免疫光镜的应用范围更大，是目前一种新的免疫细胞化学技术。

  1．免疫金—银染色原理

    免疫金—银染色方法(IGSS)的原理与间接法相似，先将特异性抗体与抗原反应，随后，用金标记的间接抗体或A蛋白再与特异性抗体结合，如果用20nm以上直径的胶体金作为标记物，应可见红色产物，此法为免疫金染色法(IGS)。

  2．各法具体操作

　（1）冰冻切片IGS染色法

在制作冰冻切片的组织中，应根据抗原性保存的要求，可先经固定液灌注或浸泡固定，也可不作固定先制作冰冻切片，然后再固定。固定过的组织可用20％蔗糖浸泡过夜，以减少冰冻切片过程中冰晶的形成。染色同石蜡切片步骤.。

（2）石蜡切片的IGS染色法

以羊抗兔IgG金标记抗体为间接抗体的一般程序如下：

    染色方法

    1)切片常规脱蜡至水。

2)经含汞固定液固定的组织切片需经脱汞、脱碘，再用流水冲洗，蒸馏水洗TBS(pH7.4)，不含汞的切片可直接进入TBS中洗涤5min×2。

    3)抗原性减弱的切片，可用0.1％胰酶在37℃中消化5～30min，抗原性强的切片可直接进入下一步。

    4)正常羊血清(1:5或10)作用10min，吸去，不洗涤。

    5)加适当稀释的特异性抗体(兔产生)，在室温中作用l～2h，或4℃下20h。

    6) 0.05mol/L TBS(pH7.4)洗l0 min，3次。

    7) 0.02mol/L TBS(pH8.2)洗10min。

    8)正常羊血清(1:5)作用10min，吸去，不洗涤。

    9)加稀释的羊抗兔IgG金标记抗体，室温下作用1h，或4℃过夜。

    10)0.02mol/L  TBS(pH8.2)洗10min。

    11)0.05 mol/L  TBS(pH7.4)洗3次，各10min。

    12)双蒸馏水洗5min。

    13)入银显影液3～5min（水剂），或20～40min（阿拉伯胶液），反应过程需避光。

  14)蒸馏水洗多次后衬染。

    15)脱水、透明和封固。

    如用金标记葡萄球菌A蛋白代替金标记间接抗体，需将正常羊血清处理，换成1％卵白蛋白。所用0.02mo1/L TBSpH 8.2者均改用pH7.4。

3．半薄切片的IGSS染色法 染色的半薄切片，可以在光镜下直接观察阳性结果，为电镜观察打好基础。

染色方法 

    (1)脱环氧树脂，切片以NaOH的无水乙醇饱和溶液浸泡30～60min，然后以无水乙醇洗4次，每次5min，再以95％、80％、70％乙醇各洗5min，水洗。

    (2)经锇酸固定的切片入1％过碘酸10min(0.5μm厚)，去锇酸，然后蒸馏水洗数次。

    (3)切片入0.05mol/LTBS(pH7.4)液中浸10min。

    (4)按石蜡切片步骤(4)以后进行IGSS染色。 

    4.试剂配制

    (1)0.05M TBS(pH7.4)液  Tris(三羧甲基胺基甲烷)12.1g，NaCl l7．5g，蒸馏水1500m1。在搅拌下加入浓HCl至pH值7.4加蒸馏水至2000m1。

    (2)0.02M TBS(pH8.2)液 Tris 4.84g，NaCll7.5g，BSA 2.0g，NaN3 1.0g。加蒸馏水1500m1，在搅拌下，用浓HCl滴入，调pH值至8.2，加蒸馏水至2000m1。

    (3)银显影液的配制：①乳酸银显影液的配制：10％阿拉伯胶水溶液或1％明胶60m1，pH3.5柠檬缓冲液10m1。搅拌均匀，加入对苯二酚水溶液(含0.85g)15m1，临用前加入乳酸银水溶液(含110mg/5m1，注意避光)。②硝酸银显影液的配制: 10％阿拉伯胶水溶液或1％明胶60m1，柠檬酸缓冲液pH3.5 10m1，含1.7g对苯二酚的水溶液30m1。上述3种溶液混合均匀，临用前加入含40mg的硝酸银水溶液2m1，注意避光。②pH3.5柠檬酸缓冲液配制构椽酸25.5g，构椽酸三钠23.5g，加双蒸水100m1溶解即成。

    对于上述两种显影液中所用25％阿拉伯胶可用双蒸水代替，此时反应明显加快，可缩短至3～5min，要在光镜下密切观察。

   四、亲合免疫细胞化学

    亲合细胞化学是利用两种物质之间的高度亲合能力而相互结合的化学反应。常用的亲和物质包括：植物血凝素与糖结合物、葡萄球菌A蛋白（SPA）与IgG、生物素与卵白素、阴(阳)离子与阳(阴)离子部位、激素、脂质和脂质与受体、以及维生素与其作用部位等。亲和细胞化学和免疫细胞化学两者可统一称为亲合免疫细胞化学。

  1．生物素、卵白素的染色原理

  (1)活化的生物素和免疫球蛋白、血凝素、毒素、激素和核酸等物质共价偶联后，加入与荧光或过氧化物酶结合的抗生物素，利用生物素和卵曰素的亲合结合，显示与生物素偶联的物质。

(2)桥式抗生物素—生物素(BRAB)技术 利用卵白素作为桥梁，联结生物素偶联物质和生物素化的过氧化物酶，从而显示与生物素偶联物质。

2．染色方法

    (1)石蜡切片，水化。冰冻切片，置空气干燥。

    (2)石蜡切片，胰蛋白酶消化。冰冻切片，丙酮固定5min。

    (3)缓冲液洗涤，正常动物血清(除制备第一抗体动物的正常血清)孵育30min。

    (4)第一抗体，置湿盒育60min。 

    (5)缓冲液洗涤，生物素化第二抗体，置湿盒孵育60min左右。

    (6)缓冲液洗涤，ABC试剂，置湿盒温育30～60min。

    (7)缓冲液洗涤，DAB—H202液显色。

  (8)缓冲液洗涤，可复染，脱水，透明和封固。

五、免疫电镜

    免疫电镜技术是在组织化学、免疫组织化学的基础上发展而来的。为了诊断和研究组织和细胞中的微细结构，利用免疫细胞化学与电镜技术的结合，从而在高分辨力的水平上，定位细胞器等超微结构中的抗原，就此形成了免疫电镜技术。

（一）免疫电镜的基本方法

  1．标记抗体法  标记抗体法分直接法及间接法。直接法标记第一抗体，特异性好，但敏感性差。间接法标记第二抗体，特异性差，而敏感性比直接法高。

2．不标记抗体法  其特点与标记抗体法不同，是采用化学方法将标记物与抗体结合在一起，通过一系列免疫学反应，把组织细胞内的抗原与标记物连接起来的方法。

   （ 1）用标记物显示有以下方法 ①杂交抗体法：杂交抗体由抗靶原抗体与抗标记物两种抗体杂交而成，先把两种抗体用木瓜酶消化成Fab片段，再创造条件使它们恢复成完整抗体。在恢复过程中两种Fab片段杂交在一个抗体分子上，具有双特异性，使用时先用杂交抗体作用于标本上的抗原，再加入标记物并呈色，可以显示组织内抗原所在，故也是一种直接法。②半抗原夹心法：此法包括三个步骤。先将事先与半抗原结合的特异性抗体作用于标本；再加入抗半抗原抗体，作为桥梁；最后加入与半抗原结合在一起的标记物。是一种间接法。③搭桥法：此法的原理是采用同种动物制备抗的特异性抗体与抗标记物抗体，再与及另一种动物制备第一种动物血清抗体的抗体。利用后者为桥梁，把抗原的特异性抗体与抗标记物抗体结合起来，后者再与标记物结合，达到定位抗原的目的。从原则上来讲，PAP法也是搭桥法的一种。

    （2）不用标记物显示有以下方法 ①C或TC作为结合剂时，第一步是结合剂上的z—氨基形成配对键而成为铁蛋白—XC或铁蛋白—NCO基团与免疫球蛋白分子上的氨基结合成示踪，但可用于单细胞表面成分的定位。在超薄切片中它们结合在细胞膜上，显示絮状的外观。在阴性染色的标本上可以见到抗体的Y字外形，利用它们作示踪物。

②抗原抗体凝集法

常用于病毒和病毒抗原的研究与快速诊断。其基本原理是病毒或病毒抗原的特异性抗体与相应抗原反应后，使后者之间发生交联而凝集。

③补体法

在特异性抗体与抗原反应后，加入补体会导致抗原所在部位，如病毒或细胞表面出现穿孔性损伤，用阴性染色法在电镜下可见该损伤区域。

    3．组织处理

二、取材与固定

    (1)取材：①单细胞：对于培养细胞与分离血细胞，应及时离心，弃去上清液，再进行固定。②外科手术和动物实验组织应及时取材和固定。

    (2)固定：为了适应免疫电镜的需要，用以下固定液较为理想：①过碘酸—赖氨酸—多聚甲醛固定液(简称PLP固定液)；②多聚甲醛—戊二醛固定液(简称PG固定液)：1％多聚甲醛加0.01％～0.05％戊二醛固定液，其组织固定时间为4～5h；③苦味酸—多聚甲醛—戊二醛固定液(简称PAPG固定液)。

    三、 组织切片

    1．冰冻切片先用低温切片机在-25℃至-35℃切片为8～20毫米厚片，用光金筛选，定性阳性

定位。

    2．石蜡切片经甲醛固定的标本，能在一定程度上保存细胞超微结构与某些抗原。将荧光素直接标记在已知特异抗体(第一抗体)上，在组织切片上标记的抗体直接与相应的抗原结合，在荧光显微镜下观察，以鉴定未知的抗原。此法十分特异简单，需时短，但敏感性较差，需要多量的抗体，而且一种抗体只能检查一种抗原，该法现已不用。   
 六、非特异性染色及染色对照

    一、非特异性染色及其消除方法

    在进行免疫组织化学染色时，组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性染色，其来源主要有以下几个方面：

    1．内源性过氧化物酶：

    内源性过氧化物酶主要存在于红细胞和粒细胞，固定不好是内源性过氧化物酶的另一来源。

    2．第一抗体：

    制备第一抗体的抗原纯度不高，其杂蛋白产生的非特异抗体会吸附到组织细胞上造成非特异性染色。其去除的方法：一是尽可能高地稀释抗体，减低非特异抗体的浓度；二是一抗孵育之后用PBS充分冲洗，因非特异抗体结合不牢，冲洗使其解离；三是在滴加抗体之前，滴加正常血清，以封闭非特异结合位点。

    3．第二抗体：

将IgG从血清中分离出来时，其中同时存在四种成分，四种成分成分中除特异性抗IgG外，其它成分可以通过与组织结构的特异性交叉反应或通过非特异的疏水键与组织或细胞结合，产生非特异性染色。去除方法基本同上。

    4．自发荧光：

    主要指经固定后组织产生的自发荧光，用硼氢化钠处理切片10min可消除。

    二、染色对照

    进行免疫组织化学染色时，必须证实组织内显示的荧光或有色产物确实是抗原与相应的特异性抗体结合所产生的。因为影响免疫组织化学染色的因素很多，因此，设严格的对照才能对染色结果作出正确的评价。常用的染色对照有：

    1. 阳性对照

用己知抗原的组织切片与待检标本同样处理，染色结果应为阳性，称阳性对照。

  2. 阴性对照

    用已知不存在相应抗原的组织标本染色，结果应为阴性。

3.空白对照

用缓冲液替代第一抗体是最常用的空白对照，染色结果应为阴性。

4.替代对照

用产生第一抗体动物的免疫前血清来替代第一抗体，染色结果应为阴性。这可证明待检组织切片的阳性结果不是抗体以外混杂的血清成分所致，而是该抗体与组织内抗原特异性反应的结果。

另外还有吸收试验及抑制试验等。

七、抗原的修复

抗原修复（antigen retrieval）是指通过化学或物理方法暴露抗原决定簇，使抗原恢复原有的空间。抗原修复一般分为两类：化学修复法和物理化学修复法。

一、化学修复法

化学修复法主要借助酶消化来实现，蛋白酶消化可以去除抗原决定簇表面上的杂蛋白，

最主要的是打开因甲醛固定而引起的交联，从而起暴露抗原决定簇的作用，使第一抗体和抗原充分

结合。

1. 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%～0.1%，消化时间为37℃、10～40min，主要用于细胞内抗原的显示。

2胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30～180min，主要用于细胞间质抗原的显示。

二、热修复法

热修复法是以高温、高压，对常规固定的石蜡切片进行抗原修复。常用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。

1.石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10min，蒸馏水洗2 min×3。将切片插入塑料架上，将盛缓冲液的容器置微波炉内加热使温度到96℃（大约1～2min）,将切片放入修复液中，微波4档20min 96℃取出容器，自然冷却至室温。

2. 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水，将一定量的缓冲液注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅不压阀。当压力锅开始慢慢喷气时计5min，压阀加压10min，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取出切片。PBS洗。

3. 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有缓冲液的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，水温使标本到达95℃起开始计时20min，然后端离电炉，冷却至室温，蒸馏水冲洗，PBS洗。

一、标本制作
　　可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定，作免疫荧光染色用。

二、荧光抗体染色方法
　　（一）直接法
　　1．染色 切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如1：8或1：16的荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等），在室温或37℃染色30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。
　　2．洗片 　倾去存留的荧光抗体，将切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗两次，搅拌，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。
　　3．用50%缓冲（0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0～9.5）甘油封固、镜检
　　4．对照染色
　　①正常免荧光血清染色，如上法处理切片，结果应为阴性。②染色抑制试验（一步法）：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替未标记抗血清，染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。③类属抗原染色试验，前面已作叙述。
　　直接法比较简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。

　　（二）间接法
　　（1）切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。
　　（2）再滴加间接荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色30min，37℃，缓冲盐水洗两次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。
　　对照染色：①抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。②抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。③阳性对照。
　　间接法中上述方法称双层法（Double Layer Method）。另一种称夹心法，即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下：
　　①切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。
　　②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃，30min。
　　③缓冲盐水洗2次，每次5min，吹干。
　　④滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃，30min。
　　⑤如③水洗。
　　⑥缓冲甘油封固，镜检。
　　间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原，敏感性较高，操作方法较易掌握，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的研究和检查，所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。

　　（三）补体法
　　1．材料
　　（1）免疫血清60℃灭活20min，用Kolmers 盐水作2倍稀释成1：2，1：4，1：8……。补体用1：10稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价，如为1：32则免疫血清应作1：8稀释。
　　（2）补体用新鲜豚鼠血清一般作1：10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按2单位的比例，用Kolmers盐水稀释备用。Kolmers盐水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲盐水中，溶解MgSO4的含量为0.01%浓度。
　　（3）抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为1：4，补体为2单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价1：4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。

　　2．方法步骤
　　（1）涂片或切片固定。
　　（2）吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液（此时免疫血清及补体又都稀释一倍）滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定湿度的染色盒内。
　　（3）用缓冲盐水洗2次，搅拌，每次5min，吸干标本周围水液。
　　（4）滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体30min，37℃，水洗同（3）。
　　（5）蒸馏水洗1min，缓冲甘油封固。

　　3．对照染色
　　（1）抗原对照。
　　（2）抗血清对照：用正常兔血清代替免疫血清。
　　（3）灭活补体对照：将补体经56℃30min处理后，按补体同样比例稀释，与免疫血清等量混合后，进行补体法染色。
　　本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制，因而一种荧光抗体可作更广泛的应用，敏感性亦较间接法高，效价低的免疫血清亦可应用，节　省免疫血清，尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。

　　（四）膜抗原荧光抗体染色法
　　本法应用直接法或间接法的原理和步骤，可对活细胞在试管内进行染色，常用于T和B细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原和受体等的检查和研究，阳性荧光主要在细胞膜上。FACS即采用此法原理。

　　（五）双重染色法
　　在同一标本上有两个抗原需要同时显示（如A抗原和B抗原），A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用罗达明标记，可采用以下染色方法：
　　1．一步法双染色　 先将两种标记抗体按适当比例混合（A B），按直接法进行染色。
　　2．二步法双染色 先用RB200标记的B抗体染色，不必洗去，再用FITC标记的A抗体染色，按间接法进行。
　　结果：A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现桔红色荧光。

　　（六）荧光抗体再染色法
　　若切片或其他标本经某种荧光抗体染色后，未获得阳性结果，而又疑有另外的病原体存在时，可用相应的荧光抗体再染色。
　　有时存档蜡块不能再用以切片，也可用存档的HE染色标本，褪去盖片和颜色，再作免疫荧光或其它免疫细胞化学的染色。

三、荧光抗原染色法
　　某些抗原可以用荧光素标记，制成荧光抗原，标记荧光素的方法与制备荧光抗体方法相同。用荧光抗原可以直接检查细胞或组织内的相应抗体，特异性较好，敏感性较差。染色方法同荧光抗体染色的直接法。由于多数抗原难以提纯或量少不昂贵，一般很少采用此法。

1、载玻片的处理：
抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：
1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。
1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。
1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。
2、常用酶消化：
2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。
2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。
2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。
3、抗原热修复：
可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0  0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。
3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。
3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
4、免疫组化染色步骤：
（以美国ZYMED公司SP试剂盒为例）
4.1石蜡切片脱蜡至水。
4.2 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
4.3蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
4.4 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
4.5 PBS冲洗，5分钟×3次。
4.6滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
4.7 PBS冲洗，5分钟×3次。
4.8滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
4.9 PBS冲洗，5分钟×3次。
4.10显色剂显色（DAB或AEC）。
4.11自来水充分冲洗，复染，封片。

冰冻切片4~8m，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。
下接免疫组化染色操作步骤。

当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。

对照/标本无染色

① 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。
③ 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
⑤ 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。
⑥ 检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。
⑦ 检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。
⑧ 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。
⑨ 检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。
弱阳性

如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：
① 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。
② 不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。
③ 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。
④ 切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
⑤ 孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。
    如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。
非特异性染色

① 是否有效地去除了内源性酶和生物素。应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。处理的方法为：
灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。
饱和处理内源性生物素：消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。
② 是否选择使用了正确的封闭血清。电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。
③ 所选择的抗体是否符合试验要求。因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
④ 一抗的使用浓度是否过高。
⑤ 清洗是否充分。应严格操作规程。因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05mol/l Tris—HCl，0.15mol/l NaCl已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温20，效果更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。
⑥ DBA的使用是否正确。DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2。孵育时间过长也会造成背景染色。
⑦ 标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。
⑧ 检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。
免疫组化操作要点编辑本段回目录1．固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4．烤片：60℃ 30分钟或37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存
6．脱片问题： Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。
8．暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
9．封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭
10．抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。
11．背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。
12．返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。
13．显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。
14．在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。

抗原修复的方法选择
    福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。因此，抗原修复也是影响免疫组化染色结果的基本因素。抗原修复(Antigen retrieval ，AR)技术，建立在Fraenkel-conrat等人一系列生物化学研究，经1991年shi等人发展。抗原修复是指石蜡、冰冻、火棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复过程。抗原修复能最大程度地恢复在制片等过程中损失的抗原性，使原来认为不能在石蜡切片上进行IHC的许多抗体获得了良好的染色结果，成为一种有效的补救措施。
    抗原修复的方法选择，关系到组织抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色效果有很大影响。因此应当根据不同的抗原特点，采用不同的修复方法。对某些细胞内抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和细胞间质抗原（如Laminin、CoIV等）则需要用酶消化法处理切片。常用的消化酶为胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般说来，胰蛋白酶消化能力较胃蛋白酶弱，主要用于细胞内抗原的消化，胃蛋白酶主要用于细胞间抗原的消化。工作中要认真参照抗体说明书指示进行消化酶的选择，这样针对性更强，标记效果更理想。
    以高压加热方法、微波加热方法较为稳定, 高压加热方法效果优于微波加热方法和单纯加热方法。溶液的浓度对修复效果无任何影响，而PH值则影响较大。缓冲液以柠檬酸缓冲液和Tris-HCL较常用。前人的研究表明，温度高修复时间短。抗原暴露或抗原修复方法较多，其中发MW—枸橼酸缓冲液使用较多，效果最好。MW修复抗原的方法是石蜡切片脱蜡、水洗后放入修复液中，用250W的输出功率2X5min，待冷却至室温按常规处理。目前AR过程已成功应用在BioTek全自动免疫组化染色仪中。
加热AR技术

    微波加热方法. 在传统标准方法,经脱蜡、脱水和用3%H2O2阻断内源性过氧(化)物酶，石蜡切片经蒸馏水冲洗，放置在塑料Coplin缸中。加入AR液，如蒸馏水、缓冲液、金属盐液、尿素等，盖上并置家用微波炉加热5或10分钟（注意防止切片干躁）。有时在加热5分钟后，间隔1分钟，再加热5分钟（在第一个5分钟后检测液体高度）。加热后，从微波炉取出塑料Coplin缸，冷却15分钟。片子经蒸馏水冲洗二次后在PBS液中浸5分钟，才进行IHC染色。为了保持一致的加热条件，必须设定靠近微波炉中心相同的位置及同一编号的Coplin缸 ，按照不同的抗体设定不同的加热时间，尽可能的建立标准的加热条件。
    微波（MW）加热过程如下：在专用盒内放入200ml柠檬酸缓冲液（PH6.0±0.1），并盖上带有小孔的盖子，微波加热至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架中，放入已沸腾缓冲液中，有作者提供做免疫组化时采用微波炉中等功率800W，微波炉选用解冻档的国产家用微波炉(根据目前的研究,建议用医用微波炉)，中档继续处理10-20分钟；取出微波塑料缸冷却至室温，从缓冲液中取出玻片，片子经蒸馏水冲洗二次，之后用PBS（PH7.2-7.4）冲洗两次，每次3分钟。
    15分钟的冷却必须：1、如这一步省略，对于有些抗体而言，会降低AR-IHC染色强度。2、突然从高温到低温可导致组织片掉片。3、可能引起形态学的变化。
    单纯加热方法：将切片放入盛有柠檬酸缓冲液的容器中,置电炉（600W）上加热至沸腾，并持续10min 。Shi等人用单纯加热方法与微波加热方法比较IHC染色强度，显示两种方法导致相同的染色强度。
    高压加热方法：Shin等人发展了含水高压锅煮沸方法，来增强福尔马林固定的脑组织tau蛋白免疫反应性。将切片连同柠檬酸缓冲液放入高压锅内，加热至产生喷气，并持续2min，压力锅离开热源，加热长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅到压力锅离开热源总时间在5-8分钟，时间过长可能会使染色背景加深。现试剂公司提供的大多数抗体都建议使用高压锅煮沸方法，这几年的实践表明，采取此方法可避免假阳、阴性，使IHC染色效果更佳。
非加热AR技术

   非加热AR技术包括酶消化、酸水解等方法。目前，主要是酶消化，酶消化是以化学的方法来打断醛键，修复抗原。
    胰蛋白酶消化法：取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100ml0.05％或0.1％PH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可；或由迈新提供的0.125%的液体胰酶。将切片放入湿盒内37oC温箱中消化18-20分钟。
    胃蛋白酶消化法：用0.1mol/L HCL配制成0.4％的胃蛋白酶；
链霉蛋白酶消化法 . 将链霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中，浓度为o.1％，消化时间20min。
抗原修复(AR)操作要点

    加热持续时间和强度是重要的影响因素之一，AR液的PH值、浓度、化学成分也是重要的影响因素之一。使用低PH值AR液必须使用阴性对照片，以防止定位不准。Shi等人强调修复缓冲液的PH值对某些抗原的修复十分重要,实验中我们也发现要获得满意结果必须选择抗原修复液的最适PH值。在常规石蜡切片做AR-IHC，采用不同浓度的Alcl3液做AR液，发现4%的Alcl3取得最理想的染色。在修复的抗原中，金属盐可影响蛋白的结构。郑辉等人使用0.01mmol/LPBS、0.01mol/L柠檬酸缓冲液、0.1mol/L Tris-HCL缓冲液及1mmol/L EDTA-Na2，于微波修复抗原，发现其阳性强度逐渐增强。高温抗原修复因其机理相当复杂，对某些存在的问题很难用设计对照的方法加以解决，有些抗体在冰冻切片上呈阴性反应，但在石蜡切片用抗原修复后却能很好的显示。对某些应表达在胞浆或表达在核内的抗原，经过量修复后，绝大部分表达在核内，例如，P185、Bcl-2、P-gp、Nm23，而有些表达在核内的抗原经过量修复会出现在胞浆内，例如P53、PcNA、Ki-67等。在使用该方法时一定小心，对结果的判断也要客观地作出分析，侯宁等人发现端粒酶逆转录酶（TRT）经过抗原修复与不经过抗原修复，其染色效果明显不同，后者的阳性率明显高于前者。操作中还应注意如下问题：
1、热处理后应注意自然冷却。
2、热处理时要防止切片干燥。
3、应根据不同的抗体选择合适的抗原修复方法。
4、一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。
5、注意形态学结构的改变(一般经高温修复后胞浆会明显的破坏，而对细胞核的影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象，而经酶水解的切片，其细胞浆破坏视消化时间而异，但核破坏较轻)。
6、如果在常用的缓冲液中无法实现抗原修复，或经修复后抗原定位发生改变，可改用一些不常用的缓冲液，或加一些螯合剂，如EDTA等可改善某些抗原的修复。
用于IHC消化的酶很多，所选酶的种类，使用的浓度，PH值，消化时间及温度等均要视组织固定的不同，所检测抗原的性质、组织类型的不同而异，应通过预实验摸索确定。使用酶消化的原则：胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于细胞内抗原，如Keratin，CEA，GFAP等。胃蛋白酶则主要用于细胞间质抗原的检测，如fibronectin，Laminin，各型胶原等。一般来言，消化时间和组织固定的长短呈正比。在用酶消化，热修复后均不能获得结果的前提下使用抗原修复与酶消化结合的方法，有时会取得较为满意的结果。一般蛋白酶K和微波相结合，但应注意，可能检测的抗原无论何种性质均会在核内出现假阳性反应。
免疫组化阳性病例的评判及相关问题编辑本段回目录对于免疫组织化学后切片的评判，要做到准确、客观，必须具备以下几个条件：
1．主要细胞阳性。即靠其作出诊断的病变细胞，在一张切片中，有各种各样的细胞，有正常的和病变的，有的切片是以病变的细胞为主，有的则是正常的或炎症组织细胞为主。如鼻咽部粘膜组织的活检，其表面有一层粘膜上皮，CK和EMA标记时，它可显示出很强的阳性，但这种不能作为诊断的依据，必须认真地观察上皮粘膜下的组织，这个地方才可见到有病变的组织或细胞。如在这地方出现细胞的异常，即细胞大小不一，核染色深或者排列紊乱，加上CK和EMA阳性，即可作出阳性的诊断，有条件的还必须作一张嗜银纤维的染色，这对于诊断很有帮助，如癌细胞周边可有大量嗜银纤维围绕，癌组织或细胞中没有嗜银纤维的存在。
1.2阳性细胞的阳性物定位要准确，不能模棱两可，是是而非。
阳性细胞所出现的阳性物，无非是在细胞核、细胞膜和细胞浆，但不管在什么部位都要定位准确。例如Er和Pr，它们的阳性物是在细胞核，如果在细胞浆中见到棕黄色的反应物，也应判为阴性。因为具有生物学效应的细胞核内受体才是真正的受体，又可称为工型受体；而细胞浆内的所谓受体，实际上是一种能与性激素结合的大分子蛋白，其功能只是将性激素从胞浆转送到核内的载体作用，实非真正受体，故也可称为Ⅱ型受体。至今为止，于核内阳性的抗体有：Er, Pr，P53, Bcl－6，BRCA1，HBcAg，HCV，ki-67,　P16，P21，P63，PCNA，ToPoⅡ，在判断核内阳性时，除了核内有真正的阳性外，其余都应判为阴性。
1.3 每批检测的切片，都须设有准确的阳性、阴性或空白对照片，以确保检测病例的准确性和可靠性。
阳性对照片是用已被免疫组化确定为阳性的病例或者选用某些组织一定含有的抗原（如标记CK时，上皮组织表达一定阳性）作为阳性对照片，于每天的免疫组化染色中与待检片一起进行染色，最后的结果阳性片一定阳性，以其为标准，来评判每一例切片。在每一批免疫组化的检测中，并非所有的切片都是阳性，也并非所有的切片都为阴生，有了正确的阳性对照片，对于无表达的阴性片，就能够确切地、干脆地作出阴性的判决。阳性对照片的设立，可以排除假阴性。
在设立阳性对照片时，应以每天新鲜切片的病例为最好。以往，有人为了贪图方便，一次性切了大量的切片贮备着，作为每次使用的阳性对照片，经实验证明：这种方法不可取，因为切片切好后长期存放，会使切片上的抗原受到破坏，随着时间的延长，切片上的抗原会逐步消失，最后阳性片也呈阴性。另者，切好后的切片如存放于4℃冰箱中，对脱蜡也极为不利，切片不是不易脱蜡就是脱蜡不干净，影响标记或造成背景的染色，效果不好。
1.4 可以利用自身设立阳性对照片。
为了节省抗体，节省人力和物力，可以正确地使用自身对照的方法。在一批待测片中，如有确定的欲测抗原，就不需专门设立一张阳性对照片，而可利用欲测切片上的必定阳性组织来进行。如检测B细胞或T细胞时，有淋巴结的切片，这种情况就可以不设阳性对照片，阳性对照片的设立，一是排除待检片中的假阳性，假阴性病例；二是检测操作中有没有存在技术方面的问题，如果操作不当，就不可能得到阳性结果或出现假阴性。现在各单位，每天检测的项目都特殊多，如果每项都设立一张对照片，是不可能的，因此，要准确地选择对照片。
2．如何解释免疫组织化学染色后切片中许多不该着色的成分都着色的问题？如标记淋巴组织细胞时，有的上皮细胞也着着，标记CK时，肌层组织也着色，这究竟是什么原因呢？
2.1 在各种组织中，都存在着各种酶，一般认为，酶蛋白和辅助因子单独存在时，它们都没有活性，因而也就没有催化底物这一功能。但是，当它们结合在一起时，就具备了酶的特有性状，催化底物的作用。在检测的各种组织中，往往就存在上述的情况。当加入标记的抗体后，这些抗体中都含有与同种类属相应的酶蛋白或辅助分子，当它们与撒落于各种组织中的酶蛋白或辅助分子结合后，就可以产生效应，催化底物，并产生不溶性的棕黄色。检测的切片含有各种成份，如上皮、肌组织和神经、间质等待。当测其中的某一项目时，其它成份由于受到影响，便会产生各种不同的反应。如检测CK时，由于含有上皮成份的组织在固定前没及时处理好，造成这些组织的变化，将部分的抗原撒落扩散到周边组织，周边组织可将这些抗原吸收，吞噬或吸附，因而在最后显色时就可以被显示出来。
3．膜性表达的抗体，为什么会出现膜性的加宽、加厚，并出现浆中表达的现象，这可能与下面的情况有关：
3.1 抗原的融合，导致膜性抗原的膜加大加厚，组织由于固定不及时，抗原向两边扩散，加宽了膜性的表达，就如同我们写字时有润纸的现象，当下笔时，写下的墨水向两边浸润一样。
3.2 切片的原因导致误认为细胞浆中的表达。
对于细胞密集的组织，由于其排列不在一平面上，当切片时，有的细胞被拦腰切断，这种有完整的细胞膜，有的被部分切断，细胞膜则仅有片块状，有的则切到盲端，而这盲端遮盖了另一细胞的断面，如同另一细胞的浆内物质，这种现象可将其称为“切片现象”。
4. 评判界定免疫组化染色阴性必须具备的条件。
4.1 阳性对照片表达阳性，待测片诊断细胞呈现阴性。
4.2 自身对照阳性，诊断细胞阴性。
4.3 经特殊手段如抗体修复时间延长，或者双重抗原修复，诊断细胞仍呈阴性。
非同位素原位杂交组化与免疫组化联合法Protocal编辑本段回目录　　（1）将切片漂浮于能经受高压灭菌的器皿中。0.1mol/l PBS pH7.2冲洗3×5min。
　　（2）0.1mol/L甘氨酸PBS冲洗5min。
　　（3）0.4% Triton X-100 PBS 15min。
　　（4）1μg./ml蛋白酶K（0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA 配），37℃保温30min。
　　（5）4%多聚甲醛PBs 5min。
　　（6）PBS冲洗2×min。
　　（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配）10min。
　　（8）2×SSC冲洗10min。
　　（9）将切片用灭菌吸水纸吸干，然后入杂交液。核酸探针浓度为0.25～0.5μg./ml。每一正常成年大鼠脑冠状切片15μl杂交液足够。43℃保温12～16h。
　　（10）4×SSc 37℃冲洗30min。
　　（11）2×SSC（含RNasea 20μg/ml）37℃保温30min。
　　（12）1×SSC和0.5×SSc 37℃分别冲洗30min。
　　（13）0.05mol/l PBS冲洗3×5min。
　　（14）0.5%H2O2 PBS室温20min。
　　（15）0.05mol/l PBS 冲洗2×5min。
　　（16）碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体（Fab）与抗蛋白或多肽等抗体混合液，前者一般1：1000稀释，后者则因抗体而异。稀释液：1%BSA，0.4%Triton X-100 ,0.05mol/L PBS pH7.2，4℃孵育24h。
　　（17）0.05mol/l PBS冲洗4×5min。
　　（18）二抗（1：100～1：200）37℃保温1h。
　　（19）0.05mol/l PBS冲洗3×5min。
　　（20）PAP（1：200～1：400）37℃保温1h。
　　（21）0.05mol/l PBS冲洗3×5min。
　　（22）DAB显色液（0.05%DAB + 0.03% H2O2,0.05mol/L PBS pH7.2配）显色5～10min。
　　（23）0.05mol/l PBS冲洗3×5min。
　　（24）TSM，冲洗2×5min（TSM1：0.1mol/l Tris – HCl pH8.0,0.1mol/L NaCl,0.01mol/L MgCl2）.
　　（25）硝基四氮唑蓝（400μg/ml）和5-溴-4-3-吲哚磷酸（200μg/ml）混合液（TSM2配显色混合液）显色1～3h，避光。
　　（26）20mmol/l EDTA终止显色。
　　（27）将切片贴于涂有铬矾明胶的载片上，空气干燥。
　　（28）梯度酒精脱水，透明、封片。

二甲苯，酒精（100％，95％），EDTA抗原修复工作液（pH8.0，稀释50倍使用），0.5M Tris-NaCl (TBS) pH7.4（稀释10倍使用）, DAB显色液（临用前配制：试剂盒A、B、C各50ul，于1ml水中混匀）。

方法
1. 石蜡切片置60℃烘箱中烘烤过夜
2. 二甲苯中脱蜡，梯度酒精入水(无水乙醇，95％酒精)，浸泡于蒸馏水中待用
3. 抗原修复
  取500mlEDTA抗原修复工作液于1000ml烧杯中，在小功率电炉上加热，至似沸微沸（为了防止脱片）。将组织切片缓慢放入烧杯。继续加热，保持液体在微沸状态20分钟。将烧杯移开火源，室温下自然冷却后取出切片，蒸馏水洗1次3分钟，TBS洗2次每次3分钟。
4. 每张切片加一滴或50ul 3％过氧化氢溶液，室温下孵育10min， 以阻断内源性过氧化物酶的活性。 TBS冲洗3次，每次3min。
5. 除去TBS液，加一滴或50ul 一抗（灭活PLB免疫小鼠所得到的多抗，1:3000稀释），阴性对照采用普通血清， 室温下孵育2小时，或4℃过夜。
6. TBS洗3次，每次5min，除去TBS液，每张切片加一滴或50ul polymer enhancer（试剂A）， 室温下孵育20min， TBS冲洗3次， 每次3min。
7. 除去TBS液，每张切片加一滴或50ul 过氧化物酶标记的抗鼠/兔聚合物（试剂B），室温下孵育30min，TBS洗3次，每次3min。
8. 除去TBS液，每张切片加一滴或50ul 新鲜配制的DAB，显色3－10min。
9. 自来水冲洗，苏木素复染10min，水冲洗。0.1%的盐酸分化，自来水冲洗，TBS返蓝。
10. 不需脱水，直接用中性树脂封片。