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流式细胞仪的应用体会

标签: 流式细胞仪 应用体会

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流式细胞仪(flow cytometry,FCM)是集激光技术、电子技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器,具有灵敏度高、重复性好、特异性强、方法灵活、分析速度快等优点。我院自2000~2002年用美国BD公司生产的FACSC-ALIBUR流式细胞仪,结合科研医疗开展了淋巴细胞亚群(CD3、CD4、CD8、CD19、CD56)分析、白血病免疫分型、DNA分析、活化淋巴细胞CD25的测定、CD34动态监测等的临床和科研项目。现将使用流式细胞仪的体会总结如下。

一、流式细胞仪的基本用途

流式细胞仪可以同时检测单个细胞的多种细胞参数。

1.内部参数:前向角光散射(FSC)显示细胞的大小,侧向角光散射(SSC)显示细胞质的颗粒性。从内部参数可了解细胞的大小、形态、细胞质的颗粒性、色素含量等。

2.外部参数:对细胞的某一待测成分进行特异性荧光标记后进行检测,包括DNA成分及含量、RNA含量、细胞表面和细胞内的各种抗原、细胞功能活性检测等,分析范围很广且特异性强。流式细胞仪能以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行检测,测定的细胞总数可达数千、数万,使得样本能在较短时间内得到全面和准确结果。

二、样本的采集和单细胞悬液制备的质量控制

用于流式细胞分析的样本须是单细胞悬液。

1.血液、骨髓是天然的单细胞悬液,可直接染色分析。标本用肝素抗凝,需在6小时内进行抗体标定染色,时间过长,细胞活性降低,影响分析结果,48小时后的标本无分析意义。有些试验以某一群细胞为检测对象,须将所测细胞成分分离出来。本院常用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞,制成单细胞悬液。

2.实体组织标本单细胞悬液的制备:取手术切除的新鲜组织的可疑部分用眼科镊夹取小块组织置钢网上轻轻擦磨,同时用PBS缓冲液冲洗,收集冲洗下的单细胞悬液,调细胞浓度至lxl06/ml,经150目尼龙膜过滤、离心,取沉淀物加70%乙醇固定备用。应注意在钢网上擦磨的过程中,用力要适当,用力过大,对细胞损伤较大,产生大量细胞碎片,影响分析。

三、单细胞悬液荧光染色的质量控制

荧光染色对流式细胞分析关系重大,我科使用的荧光染料有:PE、FTTC、cychrome、PI等,操作时将标本和染色剂加人试管底部,混匀,避光(光亮可造成荧光淬灭),室温放置20分钟,如室温过低影响染料结合,可适当延长染色时间。血液、骨髓标本染色后经溶血、洗涤、固定过程即可上机。应注意标本和试剂用量很少,不应加到试管壁上,防止标本和试剂不能充分接触着色。溶血一定要充分,没有完全溶解的红细胞及碎片的存在影响检测分析。

四、上机检测分析的质量控制

上机获取前使用BD公司提供的质控微球(calibrate bends)来设置和调节仪器的各种参数于最佳状态,如设置光电倍增管(PMT)电压,调节荧光补偿,检测探测器的灵敏度,使仪器的变异系数(CV值)在2%以内。

每一个标本都需同时做一个阴性对照管,由于质控微球和细胞有着不同的光学性质,上述的仪器设置对于生物体标本不一定是最合适的,因此还要用空白标本来调节仪器,使其进一步优化。同时,对空白对照管进行图像分析,可以了解是否有可能导致错误结果的非特异性染色的存在。获取分析时小心观察设门情况,即把要分析的细胞设置在门内,尽量减少其他细胞和碎片的掺人,获取细胞数(每个试验要求不同)要足够。

五、仪器的使用的几点体会

该仪器的液流管道很细,使用中要保持管道的清洁、通畅。

1.该实验中所有自配试剂(PBS缓冲液、溶血素、多聚甲醛固定液)、H20、次氯酸钠洗涤液,均用0.45μm滤膜过滤,以去除一般蒸馏水中的杂质。鞘液使用血细胞计数仪稀释液,这样减少了仪器液流管道的污染和杂质对实验的干扰。

2.开机待仪器状态稳定后,按下prime按钮,排除进样针内的气泡,以免气泡占位影响获取。

3.样本上机前应先查看一下管内的液体中是否有沉淀物,如有应去除。DNA样本的碎片和沉淀物较多时,应在上机前再次过滤,取滤液获取,获取后按流速Hl挡冲洗管道3~5分钟,再继续分析其他样本。

4.上、下样本管时,用力不要太大,因为用力太大会对仪器光路系统产生震动,久而久之,会使光路偏移,影响测试结果。

5.每天检测完后,应认真清洁进样针的内外管,防止进样针堵塞和有荧光染料污染管道。方法是在上样管中加10%的次氯酸钠3ml,打开支撑臂,放好上样管,外洗进样针,洗到管中液体剩1ml左右,合上支撑臂,流速选择HI挡,内洗进样针10分钟左右,再换上过滤蒸馏水重复上述步骤,然后按下PRIME按钮,观察进样针吐出的气泡是否通畅,如不通畅,还需反复冲洗。

6.按standby挡10分钟待仪器的激光状态稳定后关机,应注意上样管中是否盛有水,以防止进样针有结晶形成。

7.流式细胞仪使用一段时间后,在鞘液管路、废液管路和流动池中会有残留的碎片、污染物等,因此需要定期清洗。我们2~3个月左右清洗一次,方法是在鞘液桶内换上2%~3%次氯酸钠,拔去鞘液过滤器的接头,将鞘液桶的接头插人,冲洗2小时左右,将鞘液桶洗干净,换上鞘液,再洗1小时左右,最后将鞘液过滤器和鞘液桶的接头插回原位。

8.该仪器较精密、昂贵,应放置于清洁、避光、干燥的仪器室内,尽量避免在试验中断电,为防断电而导致电压不稳,最好能配上不间断电源。操作人员要严格按仪器操作规程操作,认真保养仪器,以保证仪器正常工作。

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