生命经纬知识库 >>所属分类 >> 常用实验技术   

流式细胞仪的技术指标与主要构造(图)

标签: 流式细胞仪 技术指标 主要构造

顶[2] 发表评论(10) 编辑词条

流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。

一、主要技术指标

1.流式细胞仪的分析速度:一般流式细胞仪每秒检测1000~5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。

2.流式细胞仪的荧光检测灵敏度:一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差>5%即可区分。

3.前向角散射(FSC)光检测灵敏度:前向角散射(FSC)反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm~0.5μm。

4.流式细胞仪的分辨率:通常用变异系数CV值来表示,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。

5.流式细胞仪的分选速度:一般流式细胞仪分选速度>1000个/秒,分选细胞纯度可达99%以上。

二、主要构造和工作原理:流动室及液流驱动系统

流动室(Flow Cell或Flow Chamber)是流式细胞仪的核心部件,流动室由石英玻璃制成,单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心,细胞在此与激光垂直相交,在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动,控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成,只要调整好鞘液压力和标本管压力,鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向,能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等,从而使激光激发的荧光信息准确无误。流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种,供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。

三、主要构造和工作原理:激光光源及光束形成系统

流式细胞仪可配备一根或多根激光管,常用的激光管是氩离子气体激光管,它的发射光波长488ηm,此外可配备氦氖离子气体激光管(波长633ηm)和/或紫外激光管。

流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的,荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关,激光是一种相干光源,它能提供单波长、高强度、高稳定性的光照,正是能达到这一要求的理想的激发光光源。

在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜,将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22μm×66μm),在这种椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布,使通过激光检测区的细胞受照强度一致。

四、主要构造和工作原理:光学系统

流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成,大致可分为流动室前和流动室后两组。流动室前的光学系统由透镜和小孔组成,透镜和小孔(一般为2片透镜、1个小孔)的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束,使激光能量成正态分布,使通过激光检测区的细胞受照强度一致,最大限度的减少杂散光的干扰;流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成,滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。滤光片主要有三类:长通滤片(LP)——只允许特定波长以上的光线通过,短通滤片(SP)——只允许特定波长以下的光线通过,带通滤片(BP)——只允许特定波长的光线通过,不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管(PMT),如接收绿色荧光(FITC)的PMT前面配置的滤光片是LP550和BP525,接收色橙红色荧光(PE)的PMT前面配置的滤光片是LP600和BP575,接收红色荧光(CY5)的PMT前面配置的滤光片是LP650和BP675。

五、主要构造和工作原理:信号检测系统

当测定标本在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号,散射光分为前向角散射(Forward Scatter, FS)和侧向角散射或900散射(Side Scatter,SS),散射光是细胞的物理参数与细胞样本的制备(如染色)无关;荧光信号也有两种,一种是细胞自发荧光它一般很微弱,一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光,它是我们要测定的荧光,荧光信号较强,这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由,以便从测出的荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异结合产生的荧光。

前向角散射(FS)反映被测细胞的大小,它由正对着流动室的光电二极管装置接收并转变为电信号;侧向角散射或900散射(SS)反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状,它由一个光电倍增管(PMT)接收并转变为电信号,这些电信号存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。

流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488ηm,氦氖离子气体激光管发射光波长633ηm)。488ηm激光光源常用的荧光染料有FITC(异硫氰酸荧光素)、PE(藻红蛋白)、PI(碘化丙啶)、CY5(化青素)、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。他们的激发光和发射光波长分别是:

各种荧光信号由各自的光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号后存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。

六、主要构造和工作原理:信号存储、显示、分析系统

(一)信号存储

存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内的数据一般是以List mode(列表排队)方式存入的,采用List mode方式有两大优点:①节约内存和磁盘空间;②易于加工处理分析。

(二)信号显示和分析

由于List mode方式数据缺乏直观性,数据的显示和分析一般采用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图。

1.单参数数据显示和分析  细胞的每一个单参数测量数据用直方图来显示,图中横坐标表示散射光或荧光信号相对强度值,其单位是道数,可以是线性的,也可以是对数的;纵坐标表示细胞数。一维直方图横坐标是FITC荧光信号相对强度值(对数),纵坐标表示细胞数;图中已根据阴性对照设定适当的“门”(直线门),仪器的计算机就会给出测定值(包括阳性细胞%和平均荧光强度)。

2.双参数数据显示和分析  细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。

3.三参数数据显示和分析  细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个数据组成一对(三参数测量数据和细胞数量每两个数据可组成6对数据)用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。三个荧光数据关系用分光图(prism)表示,分光图可直接给出8个数据(如用ABC代表3种荧光,可有A+B+C+、A+B+C- 、A+B-C-、 A-B+C+、 A-B+C-、 A-B-C+、 A+B-C+ 、A-B-C-)。

七、主要构造和工作原理:细胞分选系统

如在细胞流动室上装有超声压电晶体,通电后超声压电晶体发生高频震动,可带动细胞流动室高频震动,使细胞流动室喷咀流出的液流束断成一连串均匀的液滴,每秒钟形成液滴上万个。每个液滴中包含着一个样品细胞,液滴中的细胞在形成液滴前已被测量,如符合预定要求则可被充电,在通过偏转板的高压静电场时向左或向右偏转被收集在指定容器中,不含细胞液滴或细胞不符合预定要求液滴不被充电亦不发生偏转进入中间废液收集器中,从而实现了分选。分选的详细原理和操作请有兴趣者参考有关文献。

附件列表


→如果您认为本词条还有待完善,请 编辑词条

上一篇流式细胞仪应用 下一篇丁香园论坛关于显微镜问题汇总(三)

词条内容仅供参考,如果您需要解决具体问题
(尤其在法律、医学等领域),建议您咨询相关领域专业人士。
2

收藏到:  

词条信息

admin
admin
超级管理员
词条创建者 发短消息   

相关词条