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植物组织培养及其在中草药研究中的运用

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植物组织培养(Plant Tissue Culture)是应用无菌培养的方法培养植物的一个离体部分,也即是一种将自然环境中分离出来的植物细胞或组织放入含有合成培养基的瓶中,在无菌条件下使之生长或发育的方法。这项工作自50年代后期至今巳取得了很大的进展,如诱导培养胡萝卜的体细胞分化成完整植株,由曼陀罗的花药培养形成了单倍体的植株。

从而证明了植物每个体细胞都有形成整体植物的潜在能力,如植物细胞具有“全能性”,在离体培养的一定条件下能诱导其分化器官和再生成植株。70年代以后有关植物原生质体培养和体细胞杂交的研究得到了快发展,如烟草、曼陀罗、颠茄、胡萝卜、油菜等能从其原生质体经培养再生分化长成胚或完整的植物,利用原生质体融合技术已经能使烟草属和矮牵牛属的杂种细胞增殖分化成杂种植株。

因此,运用组织培养方法可以在比较简单易观察的条件下研究细胞、组织或器官的繁殖、生长和分化,以及各种外界因素对它们的影响,从而为解决农业生产和药物生产中的某些问题开辟了广阔的前景。目前已有若干重要成果应用于生产实践中: 一为营养繁殖系的快速繁殖,如以甘蔗为例,原来每亩要用蔗种0.5~1吨,用组织培养快速繁殖的幼苗进行栽培可节省大量蔗种,又如贝母繁殖率非常低,而用组织培养分化出的三个月左右的鳞茎,其大小就相当于用种子繁殖二年生的鳞茎; 另一为药物和生物制品的工业生产,药用植物的有效成分一般都从植物体提得,其产量和质量难免要受到植物的遗传性、生长条件、收获时间及贮藏和运输等因素所影响,如果能采用类似培养微生物产生抗菌素的方法生产有效成分,就可克服这些缺点,这对生长条件要求严格、生长缓慢、产量低、价值贵重的植物药更有意义,如近年来已大量培养人参组织,并提取有效成分。因此利用组织培养生产药用成分,探索天然药物生产工业化的途径是当前药物生产的一个新方向,随着大规模人工培养技术的成功,就有可能用组织培养法来代替全植物提取有效成分,这项工作将是未来研究植物药的中心课题之一。

一、培养基的组成和配制法

近年来用的化学合成培养基大致由6种成分组成:(1)糖类,(2)多种无机盐类,(3)微量元素,(4)氨基酸、酰胺、嘌呤,(5)维生素,(6)生长素。此外,有些培养基还可添加天然的汁液,如椰子汁、酵母提取液、水解酪蛋白、麦芽浸出液等,培养基中如加入0.5~1%的琼脂即为静止培养的固体培养基,否则为悬浮培养的液体培养基。不同植物材料常需要改变配方,如维持生长和诱导细胞分裂、分化的培养基配方就不同,因此配方的种类很多,目前以MS(Murashige and Skoog)培养基配方为最常用的一种基本培养基,它利于一般植物组织和细胞的快速生长。

总之,在进行组织培养研究时应根据研究目的和培养植物的种类来确定培养基的组成,除营养、诱导作用外还应当注意离子平衡和毒性问题,如水一般都采用重蒸馏水,无机盐类一般都需用化学纯的药品,pH值可用1N KOH(或NaOH)溶液和2N HCI调整。有时可以用普通药品代替,但须注意这些药品不仅应有营养价值,还须无毒。如果在工业上使用大缸深层培养细胞或组织生产有效成分和生物制品、应用培养基的量将要以吨位计量时,则采用什么代用品较为经济实用更应慎重考虑。

二、培养条件

1、温度: 对大多数植物组织20~28℃即可满足生长所需,其中26~27℃最适合。

2、光: 组织培养通常在散射光线下进行。光的影响可导致不同的结果。有些植物组织在暗处生长较好,而另一些植物组织在光亮处生长较好,但由愈伤组织分化成器官时,则每日必须要有一定时间的光照才能形成芽和根。有些次生物质的形成,光是决定性因素。

3、渗透压: 渗透压对植物组织的生长和分化很有关系。在培养基中添加食盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物质可以调整渗透压。通常1~2个大气压可促进植物组织生长; 2个大气压以上时,会出现生长障碍6个大气压时植物组织即无法生存。

4、酸碱度: 一般植物组织生长的最适宜pH为5~6.5。在培养过程中pH可发生变化,加进磷酸氢盐或二氢盐,可起稳定作用。

5、通气: 悬浮培养中细胞的旺盛生长必须有良好的通气条件。小量悬浮培养时经常转动或振荡,可起通气和搅拌作用。大量培养中可采用专门的通气和搅拌装置。

三、材料和方法


      从低等的藻类到苔藓、蕨类、种子植物等高等植物的各类、各部分都可采用作为组织培养的材料,一般裸子植物多采用幼苗、芽、韧皮部细胞,被子植物采用胚、胚乳、子叶、幼苗、茎尖、根、茎、叶、花药、花粉、子房和胚珠等各个部分。

由于植物在自然条件下,表面常被霉菌和细菌污染,故材料必须进行灭菌处理。一般用漂白粉溶液(1~10%)、次氯酸钠溶液(0.5~10%)、升汞溶液(0.01%)、乙醇(70%)或过氧化氢(3~10%)等处理后,再用无菌水反复冲洗至净,然后在无菌室内,将所取的组织迅速培养在固体培养基上。在适宜的条件下,受伤组织切口表面不久即能长出一种脱分化的组织堆块,称为愈伤组织(Callus),此种愈伤组织在适当的培养基上经一定时间即能诱导生长成整株植物,因此愈伤组织既可是某种植物代谢产物的来源,又是诱导成株的主要途径之一。

在适宜的培养条件下,还可使愈伤组织长期传代生存下去,这种培养称为继代培养。但在继代培养中,不少植物培养的组织或细胞随着再培养代数的增加,分化能力就逐渐降低甚至丧失,其原因可能是由于在培养过程中原有母体中存在的、与器官形成有关的特殊物质被逐渐消耗所致,因此可以用激素或改善营养条件使之恢复,也有认为是组织和细胞在长期培养中遗传性的改变,主要是染色体的变化,出现大量多倍性或非整倍性细胞,这种改变恢复的可能性较小。不同的培养基可以使愈伤组织具有不同的生长速度,结构也可松可紧,利用这些特性可使之分散成为单细胞或很小的细胞团。要形成单细胞培养宜在较高盐分、高生长素及高水解酪蛋白的培养基中进行,然后移入液体并经搅拌而分散成单细胞。也有用加入一些果胶酶的办法,但一般来说要得到纯一的单细胞是很少的。

在培养药用植物选材时,还应考虑到所需要的次生物质在植物体中的合成部位,如果选材和培养方法适当,可使原植物内所产主的代谢物通过细胞或组织培养发生生化转变而获得。

通过组织培养可获得有效成分,但实际上只有大量培养成功才有经济价值。因此在生产上常采用悬浮培养法来代替含有琼脂的固体培养基。愈伤组织悬浮培养的生长通常比静止培养快,这是由于悬浮培养时营养成分可较快地渗入细胞,抑制生长的代谢废物可较快地除去,同时供氧情况也较好,在进行这种培养时要注意通气与定期更新营养液,这是保证生长稳定、次生物质产量高的关键之一。

四、有效成分的形成

利用组织培养方法产生药用成分,已渐渐成为药物生产的新方向之一。六十年代以来,有些国家已经开展了薯蓣及其他有关科属植物的组织培养,研究薯蓣皂甙元的形成,探讨其生物合成机制;已知有7种薯蓣属植物经组织培养后,可获得薯蓣皂甙元或其它甾体化合物,其中三角叶薯蓣Dioscorea deltoides Wall。经组织培养得到薯蓣皂甙元的含量为0.3~2.5%,此外尚有鱼藤酮、甘草甜素、烟碱等,例如从烟草根尖细胞悬浮培养可产生2.9%(干重)烟碱。

在通常应用的基本培养基中适当添加生长激素、维生素或其他化学药品有时能使代谢物增加,如白花曼陀罗组织培养时,在培养基中加进0.1%酪氨酸可使阿托品的产量增加7倍多; 芸香组织培养时在培养基中添加4-羟基-2-喹啉酚,可促进白藓碱的合成和积累,在这两例中的添加物被认为是生物合成的前体。又如培养三分三愈伤组织时,在生长后期供给1my/1激动素,可使东莨菪碱的含量达到0.495%,比原植物中的含量提高很多。

除了培养基的组成外,环境因素也影响次生物质的产生。例如石芹的组织培养在黑暗中虽也增殖,但不形成黄酮类,而当暴露于光线中时,就能测出芹菜甙。组织培养应用在药学方面的工作虽然历史不长,但发展很迅速,它具有如下一些优点:

1、利用组织培养代替原植物的栽培以获得所需的有效成分,达到产量高,成本低的目的,还可节约土地。

2、除了应用于产生次生物质外,还可应用于生物转化。例如烟草组织培养中蒂巴因去甲基后可能生成吗啡。

3、从组织培养的定性分析中发现新化合物。例如在芸香组织培养中,合成和积累了芸香素(Rutacultin),它是一个至今尚未能从原植物或其他植物的呋喃香豆精中检测到的化合物。因而,组织培养将是获得新的生物活性化合物的一个来源。

4、一般情况下,组织培养是异养的,但也有自养的细胞系株,它们具有光合作用的能力而不依赖外界的糖类供应。这种特性将使细胞培养技术优越于全植物,并更为经济。

目前中国有关单位已成功地将麦角菌、灵芝、猴头菇等真菌进行工业化生产,高等植物组织培养在工业化中的应用也正在研究。

总之,植物组织培养这一新技术在中草药方面应用的前途是无限广阔的,它不仅有利于探讨和阐明药用植物生理、遗传和成分生物合成等一系列理论问题,而且一旦工业化生产问题得到解决,将可以为防病治病做出很大的贡献。

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