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标签: Alzheimer病 动物模型 β-淀粉样肽 脑室

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摘要: 目的 建立脑室灌注β-淀粉样肽(Aβ) 致痴呆动物模型及观测指标。方法 微泵渗透对动物脑室进行灌注可溶性大片段Aβ,侧脑室一次性注射聚集态小片段Aβ,侧脑室一次性注射可溶性大片段Aβ片段,侧脑室注射Aβ联用转化生长因子β( TGFβ) 。结果 上述方法处理后动物水迷宫和被动回避操作能力受损,学习和记忆功能损害,皮层和海马中胆碱乙酰转移酶(ChAT) 活性明显降低,抗氧化能力下降,海马神经元坏死或缺失,凋亡相关蛋白酶Bal-2、Bax和p53 增加等。结论 上述方法均可选用来作为模拟AD病理特征的动物模型。

关键词:Alzheimer 病;动物模型;β-淀粉样肽;脑室

Alzheimer 病(AD) 是包括遗传因素、慢性感染、免疫缺陷和环境毒素等多种原因引起的神经退行性疾病,其病理特征主要表现为老年斑、神经纤维缠结和神经元丢失。研究显示,β-淀粉样肽(β-amyloid ,Aβ) 是AD发病的早期共同病理促发因素,能引起氧化应激反应的增加,导致AD脑中胆碱能系统功能降低,激活糖原合酶激酶3(Glycogen synthase kinase-3,GSK3β)和促进Tau蛋白的异常磷酸化,介导炎症反应并间接损伤神经元。鉴于Aβ的上述神经毒性质及其在AD发生发展中的重要作用,一些学者采用脑室内灌注Aβ片段建立拟痴呆动物模型,以期出现与Aβ在AD中作用类似的病理特征表现。目前,Aβ脑室内灌注的方法大致有以下几种。

1  微泵渗透法灌注Aβ

微泵渗透法多采用的可溶性大片段的Aβ(如Aβ1~40 ,Aβ1~42) ,对动物脑室进行灌注的方式多为连续灌注,也有分次灌注。利用微泵连续(3~14 d) 将小剂量Aβ1~40 (300 pmol·d - 1) 注入大鼠脑室中,发现模型大鼠学习记忆能力衰退,皮层和海马中乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase ,AChE) 活性明显降低[ 1 ] , 胆碱乙酰转移酶( Choline acetyltrans ferase ,ChAT) 活性下降[ 2 ] ,模型大鼠脑内乙酰胆碱(Acetylcholine ,ACh) 和多巴胺(Dopa amine , DA) 的含量均明显降低[ 3 ] ,说明向大鼠侧脑室持续灌注Aβ1~40能导致胆碱能和多巴胺能双重神经功能损伤,这与AD脑内胆碱能和单胺能功能障的病理表征相类似;还发现模型大鼠长时程增强(long-termpotentiation ,L TP) 降低[ 4 ] ;皮层和海马内生长激素释放抑制因子(somatotropin release inhibiting factor ,SRIF) 含量明显下降[ 2 ] ,与AD患者脑内SRIF 含量下降的病理表现一致;模型大鼠海马、皮层及纹状体部位HC-3 结合力均明显下降,大脑明显发生萎缩,并观察到脑室扩大,海马CA1 区神经元损伤[ 5 ] ,提示Aβ1~40侧脑室微泵注入能引起类似AD早中期的神经退行性病变。分次灌注可分别于置泵后d5、d8和d11向大鼠单侧脑室灌注可溶性Aβ1~40 ,结果发现模型大鼠学习记忆能力下降,海马和皮层有广泛分布的Aβ沉积及神经元丢失,凋亡相关蛋白酶Bal-2 、Bax 和p53 表达增加[ 6 ] 。利用微泵向动物脑室灌注可溶性大片段Aβ能够部分模拟出AD的病理表现,并且较好地解决了使大量Aβ弥散性分布到脑内而不是在注射位点局部聚集的问题,但因其成本较高,目前国内应用尚少,但国外学者多采用此方法。

2  侧脑室一次性注射Aβ

2. 1  聚集态小片段Aβ 实验证明,侧脑室一次性注射聚集态Aβ25-35能引起动物学习记忆能力下降,胆碱能功能受损。Yoshimasa 等[ 7 ]对大鼠侧脑室一次性注射聚集态Aβ25-35 ,发现模型大鼠在避暗和Y 迷宫作业中出现学习记忆障碍,同时伴有ChAT活性下降;而Pavia 等[ 8 ]采用可溶性Aβ25-35进行了类似的研究,却没有发现ChAT活性降低的现象,说明小片段Aβ25-35只有在聚集状态才能发挥较大的毒性作用。

在国内目前应用较多的是侧脑室一次性注射聚集态Aβ25-35致痴呆模型,该模型能部分模拟AD的病理表现,但在注射针尖周围区域或脑室周围会出现Aβ沉积或淀粉样蛋白沉积以及反应性小胶质细胞和星形胶质细胞增生,使Aβ不能大量弥散性分布到脑内。

2. 2  可溶性大片段Aβ Aβ是一种由40~42个氨基酸组成的多肽,疏水基残基定位于C末端,C端越长越易沉积。短于1~31 的Aβ片段不易聚集或沉积,但长于1~36 的Aβ就能形成聚集,所以33~35 是十分重要的肽段[ 9 ] 。研究表明,基因Aβ编码区的致病性突变可使长型Aβ片段增加,最终导致细胞凋亡[ 10 ] 。不同突变的转基因小鼠的共同特点是Aβ表达速度增加,主要是长型Aβ(1~42/ 43) 增加,从而引起Aβ沉积,加速神经元退变和死亡。Aβ诱发小胶质细胞的神经毒性作用结构基础表明,Aβ的N 端是粘附小胶质细胞的必需结构,特别是Aβ10~16是必不可少的肽段,Aβ1~16是Aβ的亲水肽段,可捕捉小胶质细胞到老年斑斑块部位,是引起小胶质细胞神经毒性的第一步,但Aβ的C 端的完整性是诱发小胶质细胞发挥毒性作用的真正肽段, 没有Aβ1~40 和Aβ1~42的C端,即使Aβ能捕获小胶质细胞,也不能诱发小胶质细胞的神经毒作用,因此保持Aβ结构的完整性是发挥其细胞毒作用、尤其是介导小胶质细胞发挥神经元毒性作用的重要结构基础。

将溶解于缓冲盐溶液的可溶性Aβ1~42 (410 pmol/ 5 μl)注射进小鼠单侧脑室,发现模型小鼠在避暗、Y迷宫和水迷宫等实验中表现出学习记忆能力下降,海马部位神经胶质元纤维酸性蛋白( Glial fibrillary acidic protein , GFAP) 和白细胞介素-1β ( interleukin-1β, IL-1β) 表达明显增加[ 11 ] , 提示Aβ1~42可能是通过炎症反应介导炎性因子释放,损伤了学习记忆功能。采用可溶性Aβ1~40一次性注射入大鼠侧脑室,结果发现, 模型大鼠学习记忆能力下降, 脑中胆碱酯酶(cholinesterase ,ChE) 活性下降;过氧化氢酶(catalase ,CAT) 、总抗氧化能力(total antioxident capacity , T-AOC) 活性下降,可能原因是Aβ诱导产生的活性氧( reactive oxygen species ,ROS) 增多,而抗自由基的一系列抗氧化酶(如SOD、GSHPx、CAT 等) 及抗氧化物(如维生素C、维生素E 等) 减少,使自由基产生和消除的平衡被破坏,导致脂质、蛋白质和DNA的损伤,同时自由基增多可引起线粒体DNA 突变,导致线粒体功能障碍,而线粒体功能障碍或DNA 氧化损伤的增强可通过多种机制导致AD的发生,并造成神经元损伤;模型大鼠脑中一氧化氮(nitrous oxide , NO) 和一氧化氮合酶(nitrousoxide synthesis , NOS) 含量明显升高,外周血中NO 含量呈持续升高状态,而NOS 呈持续降低状态[ 12 ] ,NO 和NOS 的持续增高,表明Aβ1~40能激发机体NO/ NOS 机制的异常表达,Aβ1~40注入侧脑室后,直接激活星形胶质细胞产生eNOS ,致使外周血中NO 含量增高,外周血中NO 含量的持续性升高又反馈性地使外周血中NOS 的含量降低所致。这与AD 患者脑微循环血管中内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitrousoxide synthesis , eNOS) 和诱生型一氧化氮合酶(inducible nitrous oxide synthesis , iNOS) 表达增加、老年斑周围的星形胶质细胞表达iNOS 增多、额叶和海马等脑区神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitrous oxide synthesis , nNS) mRNA 或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate ,NADPH) 阳性神经元明显减少的观点一致[ 13 ]

我们采用向小鼠单侧脑室一次性注射可溶性Aβ1~40 (1g·L - 1 ×3μl) 进行药效学研究,发现Aβ1~40能引起小鼠学习记忆能力下降, 皮层MDA 含量增加, T-AOC 活力下降,MAO-B 活性升高,海马和皮层ChAT 和AchE 活性降低,皮层IL-6 含量增加,海马GSK3β表达增加。
侧脑室一次性注射可溶性大片段Aβ模型可部分模拟出AD 的病理表现,且长片段Aβ(Aβ1~40 ,Aβ1~42 ) 可能是AD 发病因素中的关键Aβ的亚型,同时可溶性Aβ在脑室中较聚集态Aβ易于弥散性分布,比一次性注射聚集态Aβ更客观地接近AD 的病理形成过程。

3  侧脑室一次性注射Aβ联用转化生长因子β( TGFβ)

由于注射Aβ聚集物会使注射针尖周围区域或脑室旁会出现Aβ沉积成淀粉样肽以及反应性小胶质细胞和星形胶质细胞增生,为避免注射位点附近的大量Aβ聚集和复杂的注射损伤的影响,采用可溶性Aβ1~40侧脑室注射联用转化生长因子β(transforming growth factor ,TGFβ) 的方法建立痴呆大鼠模型,结果发现,模型大鼠学习记忆能力明显下降,海马和皮层ACh 含量降低,ChAT 活性降低,AChE 活性升高,胆碱能功能受损[ 14 ] ,并证实TGFβ和Aβ注射后可出现大量硫黄素染色阳性的弥散性Aβ沉积[ 15 ] , TGFβ介导的细胞外基质蛋白- 硫酸乙酰肝素蛋白多糖( heparitin proteoglycan ,HSPG) 的水平增高可能是Aβ沉积的因素之一。说明Aβ侧脑室注射联TGFβ可制作出既有行为学改变又有脑Aβ沉积病理改变的痴呆大鼠模型,但该模型操作较为烦琐,造成脑组织穿透性损伤也大,目前国内应用不多。

总之,β-淀粉样蛋白与学习记忆功能损害和神经元变性有关Aβ脑室灌注动物模型可以用来研究治疗AD 的药物在Aβ聚集或沉淀、神经毒性作用和小胶质细胞的炎性反应等方面的作用。但这种模型也存在一些不足。如:该模型在导入Aβ的同时,注射本身对脑组织形成穿透性损伤,并且要想使大量的Aβ弥散性分布到脑内而不是在注射位点局部聚集仍存在许多问题。尽管如此,该类模型由于在多方面模拟了AD的病理特征,仍不失为抗痴呆药物研究的一种较理想的动物模型。

参考文献:

[1]  Nitta A, Itoh A, Hasegawa T,Nabeshima T. Beta-amyloid protein induced Alzheimer's disease animal model[J]. Neurosci Lett,1994,170(1):63-6.

[2]  Nag S , Yee BK, Tang F. Chronic Intracerebroventricular infusion of beta-amyloid(1~40) results in a selective loss of neuropeptides in addition to a reduction in choline acetyltransferase activity in the cortical mantle and hippocampus in the rat[J]. A nn N Y Acad Sci,1999,897(1):420-2.

[3]  Maurice T , Lockhart BP , Privat A. Amnesia induced in mice by centrally administeredβ2amyloid peptides involves cholinergic dysfunction[J]. Brain Res,1996,706(2):181-93.

[4]  Itoh A , Akaike T , Sokabe M et al . Impairments of long-term potentiation in hipocampal slices of β-amyloid-infused rats[J]. Eur J Pharmacol,1999,382(3):167-75.

[5]  Nakamara S , Murayama N , Noshita T et al . Progressive brain dysfunction following intracerebroventricular infusion of beta 1~42 amyloid peptide[J]. Brain Res,2001,912(2):128-36.

[6]  Wang R , Zhang HY, Tang XC. Huperzine A attenuates cognitive dysfunction and neuronal degeneration caused byβ-amyloid protein-(1~40) in rat[J]. Eur J Pharmacol,2001,421(3):149-56.

[7]  Yamaguchi Y, Kawashima S. Effect of amyloid-β-(25~35) on passive avoidance, radial-arm maze learning and choline acetyltranferase activity in the rat[J]. Eur J Pharmacol,2001,412(3):265-72.

[8]  Pavia J , Alberch J , Alvarez I et al . Repeated intracerebroventricular administration ofβ-amyloid 25~35 to rats decreases muscarinic receptors in cerebral cortex[J]. Neurosci Lett,2000,278(122):69-72.

[9]  Pike CJ , Walencewicz-wassman AJ , Kosmoski J et al . Structure-activity analyses ofβamyloid peptides contributions of theβ25-35 region to aggregation and neurotoxicity[J]. J Neurochem,1995,64(1):253-65.

[10] Neve RL. Mixed signals in Alzheimers disease[J]. TrendsNeurosci,1996,19(9):371-2.

[11] Yan JJ , Cho Y, Kim HS et al . Protection againstβ-amyloid peptide toxicity in vivo with long-term admistristration of ferulic acid[J]. Br J Pharmacol,2001,133(1):89-96.

[12] 苗建亭,李柱一,林 宏et al . β-淀粉样肽氧化应激损伤在大鼠Alzheimer病中的作用[J]. 第四军医大学学报,2001,22(15):1378-80.

[13] Gao GQ , Yao ZB , Ma JQ et al . Gene impression of neuronal intric oxide synthase in the brain of senile memory dificit rats[J].Chin J Geriatr,1999,18(4):236-9.

[14 ] 杨文明,韩明向,李泽庚. 智脑胶囊对实验性AD模型大鼠学习记忆及大脑皮层和海马结构区胆碱神经递质的影响[J]. 中国实验方剂学杂志,2002,8:21-4.

[15 ] Frautschy SA , Yang F , Calderon L et al . Rodent models of Alzheimers disease:Rat A beta infusion approaches to amyloid deposits[J]. Neurobiol Aging,1996,17(2):311-21.

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