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人类疾病的动物模型

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第一节 概念及意义

一、概念

人类疾病的动物模型(animal model of human disease)是指各种医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物。

动物疾病模型主要用于实验生理学、实验病理学和实验治疗学(包括新药筛选)研究。人类疾病的发展十分复杂,以人本身作为实验对象来深入探讨疾病发生机制,推动医药学的发展来之缓慢,临床积累的经验不仅在时间和空间上都存在局限性,而且许多实验在道义上和方法上也受到限制。而借助于动物模型的间接研究,可以有意识地改变那些在自然条件下不可能或不易排除的因素,以便更准确地观察模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究,有助于更方便,更有效地认识人类疾病的发生发展规律,研究防治措施。

二、动物模型在生物医学中的意义

1、可复制 临床上一些疾病不常见,如放射病、毒气中毒、烈性传染病、外伤、肿瘤等。还有一些如遗传性、免疫性、代谢性和内分泌、血液等疾病,发生发展缓慢、潜伏期长,病程也长,可能几年或几十年,在人体很难进行3世代以上的连续观察。人们可有意选用动物种群中发病率高的动物,通过不同手段复制出各种模型,在人为设计的实验条件下反复观察和研究,甚至可进行几十世代的观察,同时也避免了人体实验造成的伤害。

2、可按需要取样 动物模型作为人类疾病的“复制品”,可按研究者的需要随时采集各种样品或分批处死动物收集标本,以了解疾病全过程,这是临床难以办到的。

3、可比性 一般疾病多为零散发生,在同一时期内,很难获得一定数量的定性材料,而模型动物不仅在群体数量上容易得到满足,而且可以在方法学上严格控制实验条件,在对饲养条件及遗传、微生物、营养等因素严格控制的情况下,通过物理、化学或生物因素的作用,限制实验的可变因子,并排除研究过程中其它因素的影响,取得条件一致的、数量较大的模型材料,从而提高实验结果的可比性和重复性,使所得到的成果更准确更深入。

4、有助于全面认识疾病的本质 在临床上研究疾病的本质难免带有一定局限性。许多病原体除人以外也能引起多种动物的感染,其症状体征表现可能不完全相同。但是通过对人畜共患病的比较,则可以充分认识同一病原体给不同机体带来的各种危害,使研究工作上升到立体的水平来揭示某种疾病的本质。

因此,一个好的疾病模型应具有以下特点:①再现性好,应再现所要研究的人类疾病,动物疾病表现应与人类疾病相似。②动物背景资料完整,生命周期满足实验需要。③复制率高。④专一性好,即一种方法只能复制出一种模型。应该指出,任何一种动物模型都不能全部复制出人类疾病的所有表现,动物毕竟不是人体,模型实验只是一种间接性研究,只可能在一个局部或一个方面与人类疾病相似。所以,模型实验结论的正确性是相对的,最终还必须在人体上得到验证。复制过程中一旦发现与人类疾病不同的现象,必须分析差异的性质和程度,找出异同点,以正确评估。

三、人类疾病动物模型的分类

1、自发性动物模型(naturally occuring or spontaneous animal models)

是取自动物自然发生的疾病,或由于基因突变的异常表现通过定向培育而保留下来的疾病模型。如大鼠的结肠腺癌、肝细胞癌模型,家犬的基底细胞癌、间质细胞癌模型等十余种。突变系的遗传性疾病很多,可分为代谢性疾病、分子性疾病、特种蛋白合成异常性疾病等。这类疾病的发生在一定程度上减少了人为因素,更接近于人类疾病,因此近年来十分重视对自发性动物疾病模型的开发。

2、诱发性动物模型(experimental artificial or induced animal models)

诱发性动物模型是通过物理、生物、化学等致病因素的作用,人为诱发出的具有类似人类疾病特征的动物模型。

诱发性动物模型制作方法简便,实验条件容易控制,重复性好,在短时间内可诱导出大量疾病模型,广泛用于药物筛选、毒理、传染病、肿瘤、病理机制的研究。但诱发性动物模型是通过人为限定方式而产生的,多数情况下与临床所见自然发生的疾病有一定差异,况且许多人类疾病目前还不能用人工诱发的方法复制,因而又有一定的局限性。

第二节 自发性人类疾病动物模型

一、免疫缺陷动物疾病模型

1、B淋巴细胞缺陷疾病模型 临床常表现为免疫球蛋白缺失, 细胞免疫正常。如CBA/N小鼠,起源于CBA/H品系,为X-染色体隐性遗传,其基因符号为xid。纯和型雌鼠(xid/xid)和杂合型雄鼠(xid/y)对Ⅱ型抗原(非胸腺依赖性抗原)以及双链DNA 等没有反应。对胸腺依赖性抗原缺乏抗体反应,IgG3、IgM低下。如果移植正常鼠的骨髓到xid宿主,B细胞缺失可得到恢复。而将xid鼠的骨髓移植到受射线照射的同系正常宿主,其仍然表现为不正常的表型。

2、T淋巴细胞缺陷动物疾病模型 胸腺分泌淋巴细胞缺陷导致细胞免疫功能丧失,临床表现为毛发缺乏和胸腺发育不全。1966年在苏格兰的一群小鼠中发现了一种突变种--自发无毛小鼠,该鼠生长不良,繁殖力低下,易发生严重感染,到1968年对无毛小鼠进行纵膈连续切片,显示出胸腺缺失,遗传检查为常染色体隐性遗传,这种动物能接受同种或异种组织移植。现在有多种遗传性无胸腺动物,如裸小鼠、裸大鼠、裸豚鼠和遗传性无脾症小鼠动物模型。

3、T、B淋巴细胞联合免疫缺陷动物疾病模型 这是最严重的免疫缺陷疾病,动物临床表现为低γ球蛋白血症、低淋巴细胞血症,由于B淋巴细胞缺乏, 在淋巴结内生发中心消失,由于T淋巴细胞缺乏,在脾动脉周围细胞鞘和淋巴结副皮质区缩小、淋巴细胞减少。SCID(severe combind immuno deficiency)小鼠由美国Bosma M.J于1980年首次发现,1988年由Jackson实验室引入我国。遗传检查为第16号染色体上隐性突变基因,为C、B17/Icrj同源近交系。

二、遗传性高血压大鼠疾病模型

自发性高血压(SHR)是1963年在日本由冈本和Aoki从Wistar大鼠中筛选培育而成,血压呈持续升高,雄性SHR还拌有广泛结节性动脉周围炎,被用作结节性动脉周围炎动物模型。用遗传育种法已纯化了八个品系遗传性高血压大鼠,即遗传性高血压品系(SHRSP)、盐敏感品系(DS)、自发性高血压品系(SHR)、中风型高血压品系(SHRSP)、Milan 高血压品系(MNS)、Munster品系(SHM)、Sabra高血压品系(SBH)和Lyon高血压品系(LH),病理生理及组织病理学变化与人类高血压疾病有相似之处。

三、自发肿瘤疾病动物模型

几乎所有人类肿瘤疾病在实验动物中都可以有相似的肿瘤疾病,肿瘤在不同种系动物中发病率有差异,利用高发病率品系动物来研究自发性肿瘤疾病,更接近人群发病情况。小鼠乳腺癌在C3H、A/He、DBA/1、DBA/2发病率较高,在C3H雌性动物年龄超过9个月后,乳腺肿瘤发病率可高达100%;肺肿瘤多在A/He、A/JAX,皮肤肿瘤在C57L/He、BR/cd,肝脏肿瘤在C3H、C3Hf、C3He、C57,淋巴网状系统肿瘤在C58、C57L,血管内皮瘤在HK、BALB/c等发病率较高,在实际工作中应进行针对性选择。

第三节 诱发性动物模型的复制方法

诱发性动物模型的复制不外是以生物的、物理的及化学的因素作用于动物,使动物产生类似于人类疾病的生理改变。

物理因素包括机械力、温度和压力的改变、放射线 、噪音等。复制模型时要注意选择适宜的刺激强度、时间和频率。例如要观察Ⅰ度烧伤,若作用时间过长,温度过高,则会出现深度烧伤,达不到观察Ⅰ度烧伤所引起的病理生理改变的目的,模型将失去价值。

生物因素,如病毒、细菌、真菌、寄生虫、生物制品、细胞、毒素等各种致病原,通过注射或接种使动物产生相应疾病。用该方法进行复制时首先要注意易感动物与人临床症状的异同处,选用易感动物。如轮状病毒可引起婴儿急性坏死性肠炎,而犬感染该病毒后仅出现亚临床症状。人畜共患病动物模型是研究人类疾病的极好材料,现有150多种人畜共患病资料,为流行病学、病理学和临床症状学的研究提供了依据。

化学因素的作用有两方面,一是通过化学物质的烧伤、腐蚀,二是通过化学物质参与代谢实现的。在复制过程中要注意不同品种、不同年龄、体重的动物存在着剂量、耐药性和副作用的差异。如用四氯化碳复制肝脂肪变性动物模型,量过大会引起肝坏死,乃至出现急性中毒而死亡,因此,在试验前要摸出稳定的实验条件。

一、心血管系统疾病动物模型

(一)心肌缺血的动物模型

急性心肌缺血动物模型的制备方法很多,可概括分为两类,一是开胸法诸如冠脉结扎法、冠脉夹闭法、微量直流电刺激法、化学灼烧法及冠脉局部滴敷药物法;二是闭胸法,通过注射或接种使动物产生相应疾病。包括异物法如微珠堵塞法和球囊堵塞法及冠脉内注射药物诱发冠脉痉挛法。开胸法直观省时,易掌握,冠脉病变的部位恒定,个体间差异小,但需行开胸手术并要求以呼吸机辅助呼吸,创伤大,动物死亡率高达30~60%。闭胸法简便易行,手术创伤小,动物死亡率低,术后动物恢复迅速,可以选择任何一支冠脉,定位准确,且动物处于较少的生理扰乱下,用这种方法制备的模型进行实验研究,结果相对准确,误差小。

齐淑英等利用铜圈置入法制备急性心肌缺血动物模型,其机理可能在于铜圈作为异物被置入冠脉内,会诱发冠脉内血栓形成,堵塞冠脉而发生急性心肌缺血。选健康杂种犬,体重19±4kg,硫喷妥钠10mg/kg静脉注射麻醉动物,左侧卧位固定于实验台上。右颈部常规备皮消毒,横行切开皮肤,逐层分离皮下组织,暴露右侧颈总动脉,结扎其远心端,近心端剪开直径约1/2,送入8F动脉穿刺器,X线下沿穿刺器送入7F 预塑形左冠脉主干,注射38%泛影葡胺显影证实后,沿导管送入PTCA长导丝至左前降支远端, 撤出导管、将自制铜圈(用直径0.2mm铜丝,以12-16号注射针头绕制7圈而成)套在导丝上,再用PTCA导管将铜圈推送至左前降支第一分叉处,撤出导管(PTCA导管)及长导丝,铜圈留于局部,连续心电监护,间断注射造影剂。在实验中,于送入导管前静脉给予肝素钠1.5mg/kg,置铜圈前静注利多卡因2.0mg/kg,然后维持静滴(1.0mg/min)。

其结果,犬于放置铜圈后4~12min出现急性心肌缺血,冠脉造影显示铜圈远端不显影,心电图出现定位的ST-T改变,成功率100%。犬于实验结束后12h内均存活,死亡率为0。

家兔是使用最广的动物,它对造病膳食的敏感性高,容易造成高胆固醇血症与动脉粥样硬化。缺点为家兔的脂质代谢与人类不同,病变的解剖分布以胸动脉为主,小动脉常有病变;病理组织以血源性巨噬细胞吞噬脂质为主,形成泡沫细胞,不容易形成粥样斑块,亦难以形成复合性病变;网状内皮系统常伴有脂质沉积。

在含黄豆粉10%、麦粉38%、麸皮50%、盐1%及鱼粉1%的基础饲料中加进猪油与蛋黄粉,每天每只家兔喂基础饲料30~50g、猪油1.5g和蛋黄粉5g。以上述造病膳食饲喂14周。在喂食后2周内,血浆胆固醇浓度从实验前的124mg/100ml逐渐上升,第8周达到最高水平,平均值为543mg/100ml。继后胆固醇浓度明显下降,停喂造病膳食后,下降更为明显,降至180mg/100ml。主动脉病变Ⅱ-Ⅳ级者达92%,其中Ⅲ-Ⅳ级病变占62%;病变虽以细胞内外脂质沉积为主,但网状内皮系统的脂质沉淀及肝脏损伤明显减轻,死亡率降低。以该方法复制的动脉粥样硬化模型,比较符合人类的饮食情况,实验中动物健康状态稳定,死亡率较低。

二、消化系统动物模型

(一)肝硬化动物模型

选体重150~200g的Wistar大鼠,将D-氨基半乳糖配制成10%的生理盐水溶液,用1NNaOH将pH调节至7.0,以250mg/kg的剂量行腹内注射,每天一次,每周6天,约半年左右即可形成肝硬化。

在复制过程中,自股动脉取血作肝功能试验,包括血清蛋白测定、浊度试验、转氨酶、乳酸脱氢酶(LDH)、单胺氧化酶(MAO)、5'-核苷酸酶(5'-NA)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)及胆硷酯酶。分批处死动物进行尸解,观察腹水,心、肝、脾、肺肾等器官形态,用4%甲醛溶液固定,石蜡包埋,切片厚5微米,进行HE、网状纤维(Gordon与Sweet法)、胶原纤维(Van Gieson 法)及弹力纤维(Weiger法)染色。

在采用上述剂量D-氨基半乳糖长期多次注入大鼠腹腔时,动物耐受性较好。逐渐出现进食活动减少,有时解稀糖大便,腹部较为膨隆。半年内与对照组相比,实验组体重平均增长显著延缓。

尸检时可见腹腔内有腹水,0~20ml不等。心、脾、肺、肾、无明显改变。与对照组相比,早期肝明显增大、重量增加,色泽较灰黄,以后体积逐渐缩小,质地变硬,边缘较钝,肝表面可见弥漫性分布的细颗粒状结节,结节大小不一,直径约为0.5~1.5mm,结节间可见弥漫分布的纤维间隔,间隔一般较细小,其凹凸程度随病变而加深。切片HE染色、光镜下检查,在注射氨基半乳糖5个月后,肝小叶结构开始紊乱,形成大小不等的肝细胞团,有的仍见好的中央静脉,但其周围门脉区胆管上皮高度增生,其间夹有残留的个别肝细胞及少量单核多核白细胞及褐色素沉着。随着病程的延长,增生的胆管及纤维母细胞向四周呈星芒状伸展,有的与中央静脉相连。一般肝细胞变性坏死少见,大多呈增生表现。Gordon与Sweet 法染色显示肝细胞团中网状纤维少见而周围组织中存在着大量疏松的网状纤维。胶原纤维及弹性纤维均未见增多。除肝外,其余实质器官切片无异常发现。

实验动物在出现肝硬化时血清白蛋白含量稍有降低,浊度试验略增高,血清GPT、LDH、MAO、5'-NA、γ-GT与胆硷脂酶均无明显改变。

(二)动物大肠癌模型

动物大肠癌的自然发病率很低,仅田鼠较易发生大肠息肉和肿瘤。早期使用诱癌的化学剂多是芳香胺类,1965年Laqueur应用苏铁素(cycasin)及其配基-甲基偶氮氧甲醇(MAM)成功地诱发了大鼠大肠癌,之后,又合成一系列类似物。目前用以诱发大肠癌的致癌剂主要是间接致癌剂二甲阱及直接致癌剂亚硝胺类。选用的动物有小鼠、大鼠及豚鼠等。这里重点介绍二甲阱诱发小鼠大肠癌的方法。

选体重为18~20g的雌性昆明种小鼠,饲以常规饲料,任意饮水。致癌剂:对称的二甲肼(symmetrical 1,1-dimethylhydrazine,DMH),为白色粉状结晶, 每次临注射前以无菌生理盐水配成0.4%溶液,并用NaHCO3将其pH调至6.5~7.0。每周给小鼠颈部皮下注射DMH20mg/kg(即0.4%DMH溶液0.05ml/10g)一次, 连续20(或16)次。于注射日起6(或5)个月末处死动物,检查大肠的肿瘤。

据资料报导,大肠癌的发病率为81~100%。诱发的大肠肿瘤均系恶性肿瘤。肿瘤发生在肠壁的粘膜面,大多向肠内突出,肿瘤表面光滑,少数有糜烂。全部肿瘤均分布在距肛门6.5cm范围内,以距肛门3~4cm处最密集。肿瘤的组织学检查,绝大多数为腺癌。实验中还诱发了一定量的肛门肿瘤,切片检查均为鳞癌。亦可用C57BL 纯系小鼠诱癌,方法同上,但诱癌率低,仅35%,每鼠带瘤数亦少,说明此系小鼠对DMN不敏感。用DMH诱癌法,小鼠较大鼠合适,因为前者主要诱发大肠癌,后者除诱发出大肠癌外,小肠癌发病率较高,说明大鼠大肠组织对DMH敏感性不如小鼠高。此外诱癌率与小鼠的种系亦有关系,一般认为C57BL纯系小鼠诱癌率低。

注射DMH及处理小鼠、垫料时需戴手套。加强防护措施。

三、呼吸系统疾病动物模型的复制

急性呼吸窘迫综合征(RDS)

关于该模型复制方法,除国内外多数采用的油酸法外,尚有静脉注射致死量大肠杆菌内毒素、出血性休克、高浓度氧吸入等等。但目前认为用油酸法制备RDS 模型比较理想,因为这种模型的病理形态及病理生理的改变和临床所见者甚为相似,具有某些临床RDS的特点,可以做为临床研究的对象。从病理上说,注射油酸与临床诱发RDS的因素差异较大;诱发RDS的因素多种多样,表现在肺并无特异性,且本法变化迅速,典型,简便易行,故不失为一种较理想的方法。

油酸是一种毒性很强的脂肪酸,注入后首先通过神经、体液因素使肺微血管强烈收缩。随后,由于脂肪栓子阻塞肺毛细血管,造成肺微循环障碍;油酸尚可直接刺激血管,损伤血管内皮细胞及肺泡上皮,增加通透性,导致间质水肿,出血等病理改变。还有人指出,油酸有破坏肺泡表面活性物质的作用。

取体重2-3kg的家兔,将动物背位固定于实验台上,在2%普鲁卡因局部麻醉下分离一侧颈总动脉以备取血用。待动物安静后观察其一般状态,着重观察呼吸运动、舌粘膜颜色,并记录呼吸频率。由颈总动脉取血1ml(注射针管预先用20mg%肝素盐水冲洗),用丹麦radiomete微量血气分析仪测定PaO2、PCO2、 pH,并计算肺泡-动脉氧分压差(A-aDO2)。用结核菌素注射器从耳缘静脉注射油酸(化学纯,分子量282.47), 剂量为0.08ml/kg。注射后除观察呼吸频率、呼吸运动等一般变化外,分别于30、60、90、120分钟时取血1ml,重复测定血气及A-aDO2变化,与注射油酸前相比较。注射油酸后3小时将动物放血处死,开胸取肺,用生理盐水冲洗其表面血液,并用滤纸吸去表面水分,然后在普通药物天平上称重,计算肺系数。肉眼观察肺组织大体变化后,将标本用10%中性福尔马林固定液固定,按常规作病理切片镜检。

所有实验动物注射油酸前呼吸频率在40~60次/分之间,注入油酸后10分钟左右最快,可达140/分;2小时后仍保持呼吸过速,但已有减慢趋势。此外动物有明显吸气性呼吸困难,有的在60分钟自鼻腔溢出淡红色泡沫样液体,类似临床急性肺水肿。

注射油酸后血气突出变化是PaO2明显下降,60~120分钟时PaO2比开始下降30mmHg左右。PCO2与pH值变化不大,但在实验过程中一般可看到初期PCO2 值偏低,pH值偏高,后期则相反,可能与机体代谢情况及呼吸频率变化有关。

注射油酸后肺泡与动脉分压差明显加大。A-aDO2正常值在吸空气条件下为100mmHg,差值加大提示肺泡氧弥漫入动脉血发生障碍,是诊断RDS的重要依据。RDS时因肺水肿、充血、出血等影响通气与血流灌注比率,增加了无效灌注,导致重低氧血症,这种情况不能单纯用提高吸入氧分数(FiO2)纠正。

家兔正常组织呈淡红色,表面光滑,实验兔肺组织呈暗褐色,有点状或片状出血、小灶性坏死,多数动物气管内有粉红色泡沫样液体,肺体积增大。曾测定20例实验兔肺系数,平均值为10.41±2.94,明显大于正常值,提示有显著肺水肿。

镜检可见部分肺泡呈代偿性扩张,部分肺泡萎陷显示局部不张,肺泡内有水肿液及出血,偶可见有透明膜形成。

应注意必须保证油酸准确注入于血管内,因油酸总量甚微,如稍有外溢则影响很大。处死动物以放血为好。取肺时应将心肺提起,结扎并离断腔静脉及主动脉,并于气管分叉上1mm处再结扎一线,从上端剪断气管,最后连同心肺血管全部结扎离断,务求准确得出肺重量。如此模型作实验治疗用,则可根据实验要求延长动物存活时间或调整油酸剂量。

四、神经系统疾病模型

实验性变态反应性脑脊髓炎

实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)是一典型的实验模型。早在1944年Ferraro根据对一系列实验结果的总结,指出EAE和人的脱髓鞘病有相似之处。1947年Freund等报告,以脑或脊髓加Freund佐剂(FA) 进行免疫,仅需一次注射就能引起豚鼠EAE,而且成功率相当高。以后,以兔、小鼠、大鼠、 羊、猫、田鼠及猴等动物用同样方法均能复制成功,以豚鼠最为敏感。这里介绍用同种脊髓加FA进行免疫复制EAE的方法。

Freund氏左剂的制备参照Paterson的制法,液体石腊(c.p)8.5ml,无水羊毛脂(c.p)1.5ml,结核菌。用上述混合液配成4mg/ml的FA。高压灭菌后使用。

脊髓组织悬液:于实验当时,在无菌条件下先将豚鼠肝素化,然后经胸主动脉用生理盐水灌洗至无血。取出脊髓,除去脊膜,称重,用玻璃研磨器将脊髓研成匀浆,以生理盐水配制成50%悬液。

脊髓-FA乳剂的制备:将脊髓组织悬液与FA按1:1混合,用注射器反复抽注,即成乳剂。

选用体重400g左右的豚鼠,于豚鼠的四个足掌肉垫各注射脊髓-FA 0.1ml, 每只豚鼠共注射0.4ml。注射后按常规饲养。

免疫注射半月后,血清中逐渐出现抗脊髓抗体,皮肤试验呈延缓反应,而且豚鼠陆续出现后肢瘫痪,甚至大小便失禁,很易死亡。

血清补体结合反应:由豚鼠心脏抽血,以3000转/分离心30分钟分离血清。 抗原为1%脊髓生理盐水悬液,也经3000转/分离心1小时,取其上清液作试验用。补体为2应用单位,溶血系统为2%绵羊红细胞及2单位的溶血素。

皮肤试验:将豚鼠背部剃毛,用10%同种脊髓生理盐水悬液0.1ml作皮内注射, 注后当时及24、48小时观察皮肤反应。本实验在注后当时不见皮肤反应,而在24小时出现红斑或硬结,48小时仍存在,所以是延缓型反应。

组织学检查:在实验终了时处死动物,取出脑及脊髓等欲检查的脏器,福尔马林固定,常规切片、染色作镜检。可见脊膜及中央管周围有明显的淋巴样组织浸润、增厚,脊髓白质内有细胞浸润的小灶状病变及静脉周围呈套袖样浸润。神经细胞有坏死,细胞核消失呈匀质小体,或细胞体消失留下一空隙,以及细胞周围有圆细胞浸润等。在脑组织中可见到脑膜增厚,淋巴样细胞及单核细胞浸润。室管膜及脉络膜亦呈同样变化。小静脉及毛细血管周围,则呈套袖状细胞浸润。脑实质内有小胶质细胞组成的浸润灶。有些星状细胞呈核碎裂、胞浆苍白、细胞变形等。上述变化以脊髓的病理改变和瘫痪最为一致,是最特异的变化,仅见于注射脊髓加FA引起瘫痪的动物。血清抗体虽也有特异性,但与瘫痪或脊髓病变的程度无一致性关系;而皮肤反应则既有特异性,又与瘫痪及脊髓病变呈一致性。文献报导还曾指出,这种模型不能用血清抗体进行传递,但用淋巴细胞被动传递则能成功。提示病变的本质属于细胞免疫机制。至于脑内的变化,特异性较差,用FA或其它组织悬液加FA注射的动物也能发现,唯程度轻的多,可能是FA本身引起的,也可能因为其它组织和脑脊液之间有某些共同抗原性,从而引起交叉反应之故。

五、泌尿系统疾病模型

肾小球肾炎疾病模型

在动物身上建立肾小球肾炎的方法很多,最常用的是通过免疫手段,主要采用的实验动物有大鼠、兔及狗。

以生理盐水配制1:10及1:5鸡蛋白即为抗原。用兔制备抗血清,选体重2kg左右的兔,第一次用1:10鸡蛋白1ml加FA1ml作成的乳剂注射于肌肉内,以后每周腹腔注射一次1:10鸡蛋白2ml,不加佐剂,共注射8次。最后一次注射后5天,心脏穿刺抽血,3000转/分离心30分钟,得血清作沉淀反应。如抗体滴度高就可采血,将血清在56℃灭活30分钟后备用。

于上述血清中加入4倍量1:5~1:10鸡蛋白,以保证抗原处于稍过剩状态, 将溶液混匀即可。

选用体重2kg左右的兔,在实验前4小时,给实验用的健康兔静脉注射1%台盼蓝10ml,以封闭网状内皮系统,实验时由静脉注射上述抗原抗体复合物10ml,注射速度要慢。

注射后2小时,肾脏就开始出现病变,其程度随着时间的推移而逐渐明显。可在不同时间收集动物尿液、血液等进行各种检查。以后将动物处死, 取出肾脏作组织学检查。尿液检查时可发现蛋白、白细胞、红细胞甚至管型,这些改变在注射后一天已经很明显。血中非蛋白氮、肌酐等的浓度也在注射后一天即明显升高。肾脏的组织学检查显示病变呈弥漫性,两侧肾脏均受累。可以发现肾小球毛细血管充血、白细胞渗出,时间稍久者还有由于肾小球内细胞增生而出现肾小球细胞增多、小球体积增大等变化。有些肾小球囊内还可见红细胞、浆液和纤维性渗出物,严重时血管内可有血栓形成。肾小管上皮细胞常有浊肿、玻璃样变等,管腔内含有从肾小球滤过的蛋白、红细胞、白细胞和脱落的上皮细胞,有时它们凝成管型。肾间质内常有不同程度的充血、水肿和少量淋巴细胞及中性粒细胞浸润。动物死亡大约发生在注射后4天或更晚,如能存活2~3天,一般就不致死亡,一周后病变可逐渐恢复。

影响本实验的因素主要是抗体的滴度、抗原和抗体的比例。抗体的滴度要高,抗原量又要比抗体稍多,以致形成的抗原抗体复合物是溶解性的。Dixon的经验指出,肾脏病变呈急性还是呈慢性,与抗体的量及抗原、抗体的相对量有直接关系。抗体量过剩易引起急性肾炎,而抗原抗体量相等时则易引起慢性肾炎。另外,在注射抗原抗体复合物前必须把网状内皮系统充分地封闭,否则就不易成功。如果在注射前用大剂量肝素,则能预防肾炎的发生。

六、内分泌疾病模型

缺碘性甲状腺肿

地方性甲状腺肿除少数地区是由食物高碘和致甲状腺肿物质引起外,主要病因是缺碘。该模型复制方法很多,如用人工配制的低碘饮食饲养动物及用硫尿类和某些磺胺类药物抑制甲状腺组织的过氧化酶以阻碍甲状腺合成。后一种方法致甲状腺肿的机制和低碘性甲状腺肿的发病机制相差很大,不能真实地表现人类甲状腺肿的病理演变,因此在使用上受到一定限制。这里介绍后一方法。

选体重120~150g的Wistar大鼠,饲以含玉米粉46%、大米粉40%、黄豆粉10%、碳酸钙0.5%、氯化钠0.5%、以及少量维生素B粉的食物。此外每周两次饲以去离子水培养的麦芽或稻芽。其中粮食是购自严重地方甲状腺肿病区,磨粉后120℃烘拷24小时。氯化钠采用分析纯品,经750℃烘烤12小时后使用。自由饮用电阻值2000KΩ以上的去离子水。实验三天后尿碘含量显著减少,并随着实验时间的延长而不断下降。说明低碘饮食3天后大鼠即处于碘饥饿状态。

与对照组相比缺碘17天甲状腺未见肿大,但充血显著,呈暗红色外观。缺碘35天全部甲状腺都显著肿大,充血更明显。随着缺碘时间的延长,肿大加剧,但到了127天虽然甲状腺肿大,局部充血却减轻。

缺碘早期甲状腺细胞增生活跃,腺组织滤泡增多,腺上皮呈高柱状,并增生形成乳头突入滤泡腔中,滤泡腔内胶质变稀薄,PAS反应减弱。间质充血。过氧化酶联苯胺染色显示过氧化酶活性明显增强。缺碘127天后滤泡上皮高度降低, 含有乳头的滤泡数量减少,滤泡直径增大,胶质含量增加,过氧化酶活性降低等显示甲状腺病理变化由增生性逐步向胶性甲状腺肿转化。

T4值在缺碘35天以后明显降低并持续维持低水平。缺碘后甲状腺131I吸收率显著增加且峰值提前,表明大鼠处于碘饥饿中。

缺碘97天以前与对照组相比无差异。缺碘127天重量显著增加。

垂体切片用AT-PAS-OG染色,显示在缺碘35天后就持续出现促甲状腺素细胞增生肥大,说明在碘饥饿时垂体-甲状腺轴的活动加强。

低碘动物应单独饲养并严格避免含碘药物污染饲养室器皿及空气。沿海地区饲养室的空气应考虑除碘处理。

七、其它疾病的动物模型

多器官功能衰竭(MOF)

1、 新鲜鲩鱼胆汁致大白鼠MOF

(1)实验动物 大鼠,体重200~300g。

(2)器材 鲜鲩鱼胆汁、谷丙转氨酶药盒、胆红素药盒、肌酐药盒、尿素氮药盒、1%戊巴比妥钠溶液、重氮试剂、重铬酸钾溶液、95%乙醇、pH12磷酸盐-氢氧化钠缓冲液、苦味酸、蒸馏水、尿素氮标准应用液Ⅱ、DAM-TSC液、酸混合液、0.4mol/L NaOH、2,4-二硝基苯肼液、丙酮酸钠标准液、蛋白沉淀剂。大鼠固定器、厚线手套、金属灌胃管、试管、离心管、0.1~10ml吸管、微量加样注射器、721分光光度计、恒温水浴箱、手术器械一套、血气分析仪。

(3)步骤

①用标准吸管吸取鲜鲩鱼胆汁1ml,按比重法测比重并换算成毫升数。

②分别于实验前48小时向甲鼠灌胃380mg/100gb、w 的鲩鱼胆汁和向乙鼠灌以同容量的生理盐水。

③分别用1%戊巴比妥钠35mg/100gb.w进行腹腔内麻醉,并固定于鼠台上。

④手术分离大鼠一侧颈总动脉,取血1ml做血气、 酸碱指标(注意肝素化和隔绝空气)。

⑤切开颈动脉,将切口对准洁净试管口,抬高鼠尾部,向试管接血6ml,用2000转/分离心15分钟,分离血清以备检测SGPT、胆红素、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)。

⑥解剖动物内脏,肉眼观察肝、肾、肺和肠胃的变化。必要时切一小块组织放福尔马林液固定,以备病理切片检查。

2、用内毒素致家兔MOF

(1)实验动物 家兔,体重2~3kg。

(2)实验器材 内毒素、3%戊巴比妥钠、多导记录仪、兔固定台,其它同实验1。

(3)步骤

①取甲乙兔两只,甲兔于耳缘静脉注入0.1%内毒素0.3mg/kgb.w,乙兔则注入同容量生理盐水作为对照。

②将甲乙两兔分别用3%戊巴比妥钠1ml/kgb.w作耳缘静脉注射,麻醉后固定于兔台,分别做气管插管、颈动脉插管,接传感器并连接多导生理记录仪。

③注内毒素或生理盐水后60分钟、240分钟分别记录心率、血压、 呼吸和心电图,另取颈动脉血1ml(注意肝素化和隔绝空气),用血气分析仪检测血气和酸碱指标。

④继续取动脉血6ml,2000转/分,15分钟离心分离血清,检测SGPT、胆红素、BUN 、Cr的变化。

⑤实验结束前用快速放血法处死家兔,游离气管和肺脏,取出全肺计算肺系数。肺系数=肺湿重/动物体重(kg)。

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