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质粒载体的操作和cDNA文库的构建

标签: 质粒载体 cDNA 感受态 DNA酶切 电泳 DNA提取 重组质粒 DNA

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(一)细菌培养物的生长
  从琼脂平板上挑取一个单菌落,接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长),然后从中纯化质粒,质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体(如pUC系列)都能复制到很高的拷贝数,惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期,就可以大量提纯质粒。此时,不必造反性地扩增质粒DNA。然而,较长一代的载体(如pBR322)由于不能如此自由地复制,所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时,以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成,结果阻止了细菌染色体的复制,然而,松弛型质粒仍可继续复制,在若干小时内,其拷贝数持续递增。这样,像pBR322-类的质粒,从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同,前者大为增高。多年来,加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量,对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
(二)细菌的收获和裂解
  细菌的收获可通过离心来进行,而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种,这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于3个因素:质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。 尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际,但仍可据下述一般准则来选择适当方法,以取得满意的结果。
  1)大质粒(大于15kb)容易受损,故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中,然后用溶菌酶和EDTA进生处理,破坏细胞壁和细胞外膜,再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
  2)可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后,有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂,通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对,故可使宿主的线状染色体DNA变性,但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时,质粒DNA链迅速得到准确配置,重新形成完全天然的超螺旋分子。
  3)一些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株) 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类,当随后用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类,而糖类可抑制多种限制酶的活性。 故从诸 如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时,不宜使用煮沸法。
  4)当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株(endA+株,如HB101) 中小量制备质粒时,建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A,以后在温育(如用限制酶消化)时,质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚:氯仿进行抽提)可以避免此问题。
  5)目前这一代质粒的拷贝数都非常高,以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而,某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量,而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物,处理起来煞为费事,而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。
(三)质粒DNA的纯化
常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如,用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。 溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合,进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加,作为补偿,将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后,超螺旋度大为增加, 从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限,可继续结合更多的染料,直至达到饱和( 每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子) 。由于染料的结合量有所差别,线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来,氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时,为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。本实验室采用离子交换层析法已可得到极高纯度的质粒。
质粒DNA的小量制备
(一)细菌的收获和裂解
1.收获
1)将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml 并通气良好(不盖紧)的试管中,然后接入一单菌落,于30℃剧烈振摇下培养过夜。
2)将1.5ml培养物倒入微量离心管中,用微量离心机于4℃以12000g离心30秒,将剩余的培养物贮存于4℃。
3)吸去培养液,使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连,轻缓抽吸,并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时,尽可能使吸头远离细菌沉淀,然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。
2.碱裂解法
1)将细菌沉淀,所得重悬于100μl用冰预冷的溶液I中,剧烈振荡。
溶液I
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
10mmol/LEDTA(pH8.0)
溶液I可成批配制,每瓶约100ml,在10lbf/in2(6.895×104Pa) 高压下蒸气灭菌15分钟,贮存于4℃。须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散,将两个微量离心管的管底部互相接触震荡,可使沉淀迅速分散。
2)加200μl新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)
1%SDS
盖紧管口,快速颠倒离心管5次,以混合内容物。应确保离心管的整个内表面
均与溶液Ⅱ接触。不要振荡,将离心管放置于冰上。
3)加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ
溶液Ⅲ
5mol/L乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
所配成的溶液对钾是3mol/L,对乙酸根是5mol/L。
盖紧管口,将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,之后
将管置于冰上3-5分钟。
4)用微量离心机于4℃12 000g离心5分种,将上清转移到另一离心管中。
5)可做可不做:加等量酚:氯念, 振荡混匀, 用微量离心机于4 ℃以12000g离心
2分钟,将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不必用酚:氯仿进行抽提,然而由于一些未知的原因,省略这一步,往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。
6)用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。振荡混合, 于室温放置2分钟。
7)用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟。
8)小心吸去上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连,并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时,尽量使吸头远离核酸沉淀,然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。
9)用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀,按步骤8)所术方法去掉上清,在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。
i.此法制备的高拷贝数质粒(如Xf3或pUC),其产量一般约为:每毫升原细菌培养物3-5μg。
ii.如果要通过限制酶切割反应来分析DNA,可取1μl DNA溶液加到另一含8μl水的微量离心管内,加1μl 10×限制酶缓冲液和1单位所需限制酶, 在适宜温育1-2小时。将剩余的DNA贮存于-20℃。
iii.此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物:
3.煮沸裂解

1)将细菌沉淀,所得重悬于350μlSTET中。
STET
0.1mol/L NaCL
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
5% Triton X-100
2)加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制],振荡3秒钟以混匀之。如果溶淮中pH低于8.0,溶菌酶就不能有效发挥作用。
3)将离心管放入煮沸的水浴中,时间恰为40秒。
4)用微量离心机于室温以12 000g离心10分种。
5)用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。
6)在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠(pH5.2)和420μl异丙醇,振荡混匀,于室温放置5分钟。
7)用微量离心机于4℃以12 000g离心5分种,回收核酸沉淀。
8)小心吸去上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连,轻缓抽吸,并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时,尽可能使吸头远离核酸沉淀,然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。
9)加1ml 70%乙醇,于4℃以12 000g离心2分钟。
10)按步骤8)所述再次轻轻地吸去上清,这一步操作要格外小心,因为有时沉淀块贴壁不紧,去除管壁上形成的所有乙醇液滴,打开管口,放于室温直至乙醇挥发殆尽,管内无可见的液体(2-5)分钟。
11)用50μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡,贮存于-20℃。
注:当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株(endA+株,如HB101 )中小量制粒尤其DNA时,建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A,以后在Mg2+存在下温育(V中用限制酶时)质粒DNA可被降解。 在上述方案的步骤9)之间增加一步,即用酚:氯仿进行抽提,可以避免这一问题。
(二)质粒DNA小量制备的问题与对策
裂解和煮佛法都极其可靠,重复性也很好,而且一般没有会么麻烦。多年来,在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中,只碰到过两个问题:
1)有些工作者首次进行小量制备时,有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割,这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下,用酚:氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在,可用离心柱层析注纯化DNA。
2)在十分偶然的情况下,个别小时制备物会出现无质粒DNA的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。

质粒DNA的大量制备

(一)在丰富培养基中扩增质粒
  许多年来,一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效,然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中,采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物2-5mg质粒DNA,而且重复性也很好。
1)将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期(DNA 600约0.6)。培养基中应含有相应抗生素,用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。
2)将含相应抗生素的500ml LB或Terrific肉汤培养基(预加温至37℃)施放入25ml对数晚期的培养物,于37℃剧烈振摇培养25小时(摇床转速300转/分),所得培养物的OD 600值约为0.4。
3)可做可不做:加2.5ml氯霉素溶液(34mg/ml溶于乙醇),使终浓度为170μg/ml。像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒,有必要通过扩增。这些质粒只要从生长达到饷新一代的质粒(如pUC质粒)可复制达到很高的拷贝数,因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大量提纯。但用氯霉素进行处理,具有抑制细菌复制的优点,可减少细菌裂解物的体积和粘稠度,极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来,尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便,但用氯霉素处理还是利大于弊。
4)于37℃剧烈振摇(300转/分),继续培养12-16小时。
(二)细菌的收获和裂解
1.收获
1)用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。
2)将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
STE
0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
2)按步骤1)所述方法离心,以收集细菌细胞。
2,碱裂解法

1)将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物[ 来自收获细菌的步骤3] 重悬于10ml(18ml)溶液I中。
溶液I
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
10mmol/L EDTA(pH8.0)
溶液I可成批配制,在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟,贮存于4℃。
2)加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值低于8.0时,溶菌酶不能有效工作。
3)加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)
1%SDS
盖紧瓶盖,缓缓颠倒离心瓶数次,以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。
4)加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。
溶液Ⅲ
5mol/L乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
所配成的溶液对钾是3mol/L,对乙酸根是5mol/L。
封住瓶口,摇动离心瓶数次以混匀内容物,此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟,应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、 高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物。
5)用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧,可以5000转/分再度离心20分钟, 然后尽可能将上清全部转到另一瓶中,弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分[步骤4)]。
6)上清过滤至一250ml离心瓶中,加0.6体积的异丙醇,充分混匀,于室温放置10分钟。
7)用合适转头于室温以500转/分离心15分钟,回收核酸。如于4℃离心,盐也会了生沉淀。
8)小心倒掉上清,敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽,于室温用70%乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇,用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴,于室温将瓶倒置放在纸巾上,使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。
9)用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。
10)纯化。
四、质粒DNA的纯化
(一)聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA
1)将核酸溶液所得]转入15mlCorex 管中, 再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液,充分混匀,用合适转头于4℃下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA。
2)将上清转移到另一30mlCorex管内,加等量的异丙醇, 充分混匀, 用SorvallSS34转头(或与其相当的转尖)于室温以10 000转/分离心10分钏, 回收沉淀的核酸。
3)小心去掉上清,敞开管口,将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70%乙醇洗涤沉淀及管壁,流尽乙醇,用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴,敞开管口并将管侄置,在纸巾上放置几分钟,以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。
4)用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml )的TE(pH8.0)溶解沉淀,将溶液转到一微量离心管中,于室温放置30分钟。
5)加500μl含13%(w/v)聚乙二醇(PEG 8000)的1.6mol/L NaCl,充分混合,用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟,以回收质粒DNA。
6)吸出上清,用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚:氯仿、氯仿各抽1次。
7)将水相转到另一微量离心管中,加100μl 10mol/L乙醇铵,充分混匀,加2倍体积(约1ml)乙醇,于室温放置10分钟,于4℃以12 000g离心5分钟,以回收沉淀的质粒DNA。
8)吸去上清,加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。
9)吸去上清,敞开管口,将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。
10)用500μl TE(pH8.0)溶解沉淀1:100稀释[用TE(pH8.0)] 后测量OD 260,计算质粒DNA的浓度(1OD260=50μg质粒DNA/ml), 然后将DNA贮于-20℃。

重组质粒的连接、转化及筛选编辑本段回目录

  质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(<10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的,先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。
  外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种:
  1、带有非互补突出端的片段 用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段,一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点,因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体,从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时,在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。
  2、带有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。 由于质粒载体也必须用同一种酶消化,亦得到同样的两个相同粘性末端,因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以,必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。
  3、带有平末端 是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生,或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多,故在其连接反应中,T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。
特殊情况下,外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。
  本实验所使用的载体质粒DNA为pBS,转化受体菌为E. coli DH5α菌株。由于pBS上带有Ampr 和lacZ基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。
  因pBS带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pBS DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。
  pBS上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别,它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上,α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶,能分解麦康凯培养基中的乳糖,产生乳酸,使pH下降,因而产生红色菌落,而当外源片段插入后,失去α-互补能力,因而不产生β-半乳糖苷酶,无法分解培养基中的乳糖,菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α-互补现象筛选。 
材料、设备及试剂
  一、 材料
  外源DNA片段: 自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知; 载体DNA: pBS质粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。
  二、 设备
  恒温摇床,台式高速离心机,恒温水浴锅, 琼脂糖凝胶电泳装置, 电热恒温培养箱,电泳仪无菌,工作台, 微量移液枪,eppendorf管。
  三、 试剂
  1、连接反应缓冲液(10×):0.5mol/L Tris•Cl (pH7.6),100mol/L MgCl2,100mol/L 二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌),500μg/ml 牛血清清蛋白(组分V.Sigma 产品)(可用可不用),10mol/L ATP(过滤灭菌)。
  2、T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase);购买成品。
  3、X-gal储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。
  4、IPTG储液(200mg/ml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌,分装于eppendorf管并储于-20℃。
  5、麦康凯选择性培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全浴解,高压灭菌,待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50mg/ml,然后摇匀后涂板。
  6、含X-gal和IPTG的筛选培养基:在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收。
  7、感受态细胞制备试剂。
  8、煮沸法快速分离质粒试剂。
  9、质粒酶及电泳试剂。
操作步骤
  一、 连接反应
  1、取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf管, 编号。
  2、将0.1μg载体DNA转移到无菌离心管中,加等摩尔量(可稍多)的外源DNA片段。
  3、加蒸馏水至体积为8μl,于45℃保温5分钟,以使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0℃。
  4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底,于16℃保温8-24小时。
  同时做二组对照反应,其中对照组一只有质粒载体无外源DNA;对照组二只有外源DNA片段没有质粒载体。
  二、 E. coli DH5α感受态细胞的制备及转化
  每组连接反应混和物各取2μl转化E. coli DH5α感受态细胞。具体方法见第三章。
  三、 重组质粒的筛选
  1、每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。
  2、倒置平板于37℃继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。
  3、放于4℃数小时,使显色完全(此步麦康凯培养基不做)。
  不带有pBS质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。带有pBS载体的转化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯筛选培养基上呈现为红色菌落。在X-gal和ITPG培养基上为蓝色菌落。带有重组质粒转化子由于丧失了β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯选择性培养基和x-gal和ITPG培养基上均为白色菌落。
  四、 酶切鉴定重组质粒
  用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp 50μg/ml的 5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时。使用煮沸法快速分离质粒DNA直接电泳,同时以煮沸法抽提的pBS质粒做对照,有插入片段的重组质粒电泳时迁移率较pBS慢。再用与连接未端相对应的限制性内切酶进一步进行酶切检验。还可用杂交法筛选重组质粒。
  [注意] 1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关,连接平齐末端,必须加大酶量,一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。
  2、在连接带有粘性末端的DNA片段时,DNA浓度一般为2-10mg/ml,在连接平齐末端时,需加入DNA浓度至100-200mg/ml。
  3、连接反应后,反应液在0℃储存数天,-80℃储存2个月,但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。
  4、粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定,所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度为37℃,在连接粘性末端时,反应温度以10-16℃为好,平齐末端则以15-20℃为好。
  5、在连接反应中,如不对载体分子进行去5'磷酸基处理,便用过量的外源DNA片段(2-5倍),这将有助于减少载体的自身环化,增加外源DNA和载体连接的机会。
  6、麦康凯选择性琼脂组成的平板,在含有适当抗生素时,携有载体DNA的转化子为淡红色菌落,而携有带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选,且价格低廉。但需及时挑取白色菌落,当培养时间延长,白色菌落会逐渐变成微红色,影响挑选。
  7、X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶(b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylthiogalactoside),为非生理性的诱导物,它可以诱导lacZ的表达。
  8、在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上,携带载体DNA的转化子为蓝色菌落,而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落,平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分,蓝色菌落明显。 

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化编辑本段回目录

一. 概 述
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法,RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素:
1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌,最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
4. 防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr ),可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS,则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了pBS。转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行电泳、酶切等进一步鉴定。
本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr ),可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS,则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了pBS。转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行电泳、酶切等进一步鉴定。

二. 材料、设备及试剂
(一). 材料
E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ;pBS质粒DNA: 购买或实验室自制,eppendorf管。
(二). 设备
恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。
(三). 试剂
1.LB固体和液体培养基。
2.Amp母液。
3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌,待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板。
5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。

三. 操作步骤
(一)、 受体菌的培养
从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 =0.5左右。
(二)、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。
(三)、 转化
1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。
2、 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。
3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
同时做两个对照:
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落。
(四)、 计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下:
转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积
转化频率(转化子数/每mg质粒DNA)=转化子总数/质粒DNA加入量(mg)
感受态细胞总数=对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积/涂板菌液体积
感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数
[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高,需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。

附:大肠杆菌感受态细胞的制备
    感受态的细胞可以摄入外部溶液中的DNA,而常态的细胞却不能,所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。
  1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培养基的试管中,37℃振荡培养过夜
  2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培养基的三角瓶中,37℃振荡培养3h至OD600=0.3
  3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中,冰浴10min。
  4、在4℃下以4000rpm离心5min,去上清液
  5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中,置冰上30min
  6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min,去上清液
  7、将菌体悬浮于0.1ml CaCl2溶液中,冰浴放置4-12hr备用。
 
附:质粒DNA高频转化大肠杆菌
制备好感受态细胞后,接下来就是质粒DNA转化入大肠杆菌细胞的过程。但要注意的是感受态细胞最好是新制备的,因为保存一定时间的感受态细胞会使转化率降低;此外DNA的浓度也要注意,不能太高。
1、取新制备的一管感受态细胞。
2、取0.03ml感受态细胞转和4ng质粒DNA混匀,置冰浴30min
3、将 Ep管置于42℃水浴中热冲击2分钟,立即置于冰上1分钟。
4、在 Ep管中加70u1 LB培养基混匀,37℃培养30min
5、涂在含适当浓度抗生素的LB平板上。
6、37℃培养过夜,长出的菌斑既为阳性克隆。

高效感受态细胞制作编辑本段回目录

方法一
A液:1M,MnCl2:
B液:1M,HEPES,pH=6.2-6.8,用无菌水配,配后不需灭菌;
C液 称取CaCl2 0.10g,KCl 1.18g,全部转入细口试剂瓶,然后加入46ml三蒸水,轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎,然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。
取1管B液(0.6ml),全部加入C液(46ml)中,混匀后,再用1ml移液器加入3.3ml A液,混匀冰浴即可使用。
    划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时, 挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡(300 rpms)培养3-4小时, 将培养温度调至18℃剧烈振荡(3280 rpms)培养,其余与普通感受态差不多,每管加入4ml TB缓冲液,轻轻振荡,使菌体重新悬浮,加入280ml DMSO(可用国产分析纯),混匀后分装入1.5ml EP管,冰上静置15分钟。用纱布将所有装有感受态的EP管包好,用棉线系好后放入液氮中速冻,在液氮中静置12小时以上。取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。
效率非常高,一般可到10*8,好时可到10*9,特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。

    洁净是最重要的。无菌都无所谓,在操作台上可正常操作。离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。涂板要注意,不要觉得不匀而多次反复,轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可,特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。涂完后建议空气晾干(20-30分钟)这样会减少卫星菌落出现。

    预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要,只要注意就行了,我在去残液时经常在室温倒置1min,对感受态效率提高有帮助,第一次多加一点缓冲液,我经常加至20ml,效果不错。

    关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多,最复杂的莫过于电转化,而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。对于做克隆工作的人而言,高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。
    现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化,可达到1010,但是操作起来比较麻烦。要想又简单,又能有较高的转化效率,最好的莫过于1990年《gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。
    根据实验室的实际情况,我们将其稍作修改,做成了GLP文件,但其中仍有许多可改进或需要注意的地方,其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助。
1、所用器具的洁净程度。这一点非常重要,是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的,毋庸置疑。
2、培养基的装量:培养基的装量是很重要的,这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题,是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值为:培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml,50ml/250ml。
3、培养基的pH值。这是讲的pH值并非单指配置或灭菌后的pH值,而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说,接种前的pH值在6.8-7.2,等菌摇好后,可以测一下pH值,不要低于6.0,最好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢,生长状态良好,按要求做,肯定效率不低。
4、培养后的OD值。其实这并一个非常重要的参数,只是当OD值大到一定的程度后,菌体要保持对数生长已经不太可能,因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6,0.8等等。同时,OD值大时菌体总量大,因而感受态绝对数量要大一点,因而需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。
5、培养基中的各种离子。经验证明,当培养基中存在一定量的Mg2+离子时,该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时,使用20mM MgCl2做为培养基的添加物,在感受态收获之前20-30分钟加入,会收到很好的效果。
6、培养温度。文献及经验告诉我们,较低的温度培养有利于感受态的形成,这样可以获得较高的感受态,但太低又不实用,因而产生了Inoue的高效感受态制备方法,它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。
7、此外文献报道,在保存感受态时,DMSO要比甘油的效果要好,它会使感受态的效率增加。
8、液氮速冻也会使感受态的效率提高,因此推荐用液氮速冻感受态,然后保存于超低温冰箱内。至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱,这点未做实验,只是一种感觉,第一次这样做了,没问题,以后就照此办理而已。

方法二
1.液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落.
2.挑直径1-3毫米的单菌落*可多个, 接种到250毫升/3升锥形瓶 或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基. 培养基量不可再多,会影响效率.
3.在18度 150-250RPM 培养19-50小时*没有冷却摇床的可在室温, 但不可高于37度.
4.OD600约0.4-0.8时停止培养, 放在冰水中冷却10分钟
5. 4度, 300RPM离心15分钟, 回收菌体
6.去掉上清后, 用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮, 在冷10分钟
7.再次离心回收菌体
8.用1/12.5体积的TB悬浮, 添加最终浓度为7%的DMSO, 再冷却10分钟
9.0.1-1毫升分装, 直接在液氮中冻上.
10.在液氮或-80度保存.

 

(1)将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上,37℃培养活化。
(2)挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基,18℃,200-250rpm培养。
(3)当OD600=0.5-0.8时,用预冷的40mL离心管于4℃,8000rpm离心10min,收集菌体。
(4)用预冷的TB Buffer重悬菌体,4℃,8000rpm离心10min,收集菌体。
(5)重复第4步操作。
(6)用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体,缓慢加入DMSO至终浓度7% 。
(7)冰浴10min后,分装保存于液氮中。
本法效率极高,建议大家采纳


1. 单菌落-------2ml LB 37度 120RPM过夜------1%转接-------37度 200RPM2小时(OD到0.4~0.5)
2. 2ml, 冰浴15min, 4度, 6000RPM 5min, 弃上清, 悬浮于1ml0.1MCaCl2中, 冰浴20min
3. 4度, 6000RPM 10min, 重悬浮于200ul 0.1MCaCl2中, 冰浴30min
建议用TSS法,简单方便,比氯化钙法的转化效率高.别的菌可能不一定适用。
以下为转贴,具体方法请最好查阅文献。

E.coli感受态细胞制备方法:
单菌落平板至2ml LB, 37℃ 250 r/m, 1ml 转至50 ml LB, 37oC 250 r/m至 A600
=0.2-0.4
离心后用10毫升TSS重悬后,分装 -70oC保存。尽量冰上操作.
转化: 加质粒(<5 ul/100ul cell) 后冰上30分钟,42℃ 90秒,冰上2分钟,加LB至1ml
, 37℃ 1小时后铺抗生素平板。
TSS:
7.0ml pH6.1 LB
2.0ml 50% PEG6000
0.5ML dmso
0.2ML Mg2+ (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4)
0.3ml ddH2O

外源DNA和质粒载体的连接反应编辑本段回目录

外源DNA片段和线状质粒载体的连接,也就是在双链DNA5'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸,可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化,则吸能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口,当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的5'磷酸和3'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化,这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。实际上在有克隆用途中,T4噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下,它就能有效地将平端DNA片段连接起来。
  DNA一端与另一端的连接可认为是双分子反应,在标准条件下,其反应速度完全由互相匹配的DNA末端的浓度决定。不论末端位于同一DNA分子(分子内连接)还是位于不同分子(分子间连接),都是如此。现考虑一种简单的情况,即连接混合物中只含有一种DNA,也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体DNA。在瓜作用的底物。如果反应中DNA浓度低,则配对的两个末端同一DNA分子的机会较大(因为DNA分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同DNA分子的末端的概率)。这倦,在DNA浓度低时,质粒DNA重新环化将卓有成效。如果连接反应中DNA浓度有所增高,则在分子内连接反应发生以前,某一个DNA分子的末端碰到另一DNA分子末端的可能性也有所增大。因此在DNA浓度高时,连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。Dugaiczyk等(1975;同时参见Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷,第2、3期合刊)从理论上探讨了DNA浓度对连接产物性质的影响。简而言之,环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数:j和i。j是DNA分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度,j的数值是根据如下一种假设作出的:沉吟液中的DNA呈随机卷曲。这样,j与DNA分子的长度成反比(因为DNA越长,某一给定分子的两末端的越不可能相互作用),因此j对给定长度的DNA分子来说是一个常数,与DNA深度无关。j=[3/(3πlb0)]3/2其中l是DNA长度,以cm计,b是随机卷曲的DNA区段的长度。b的值以缓冲液的离子强度为转移,而后者可影响DNA的刚度。
    i是溶液中所有互补末端的深度的测量值,对于具有自身互补粘端的双链dna而言,i=2NoMx10-3末端/ml这里No是阿佛伽德罗常数,M是DNA的摩尔浓度(单位:mol/L)。理论上,当j=i时,给定DNA分子的一个末端与同一分子的另一末端,以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。因而在这样的条件下,在反应的初始阶段中,环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当j>i时,有利于重新环化;当i>j,则有利于产生多联体。图1.9显示了DNA区段的大小与连接反应混合物中j:i之比分别为0.5、1、2和5时所需DNA浓度之间关系(Dugaiczyk等,1985)。 现在考虑如下的连接反应混合物:其中除线状质粒之外,还含有带匹配末端的外源DNA片段。对于一个给定的连接混合物而言,产生单体环状重组基因组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响, 而且还受质粒和外源DNA末端的相对浓度的影响。当i是j的2-3倍(即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求,而又不致引起大量寡聚体分子的形成时)外源DNA末端浓度的2倍时,有效重组体的产量可达到最大。这些条什下,连接反应终产物的大约40%都是由单体质粒与外源DNA所形成的嵌合体。当连接混合物中线瘃质粒的量恒定(j:i=3)而带匹配末端的外源DNA的量递增时,这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。

涉及带粘端的线状磷酸化质粒DNA的连接反应应包含:
1)足量的载体DNA,以满足j:i>1和j:i<3。对一个职pUC18一般大小的质粒,这意味着连接反应中应含有载体DNA为20-60μg/ml。
2)未端浓度等于或稍高于载体DNA的外源DNA,如外源DNA浓度比载体低得多,在效连接产物的数量会很低,这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。这种情况下,可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒DNA或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。 
(二)粘端连接
1)用适当的限制酶消化质粒和外源DNA。如有必要,可用凝胶电泳分离片段并(或)用碱性磷酸酶处理质粒DNA。通过酚:氯仿抽提和乙沉淀来纯化DNA,然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。
2)按如下所述设立连接反应混合物:
a.将0.1μl载体DNA转移到无菌微量离心管中,加等摩尔量的外源DNA。
b.加水至7.5μl,于45℃加温5分钟以使重新退炎的粘端解链,将混合物冷却到0℃。
c.加入:10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液 1μl
T4噬菌体NDA连接酶 0.1Weiss单位
5mmol/L ATP 1μl
于16℃温育1-4小时
10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液
200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)
50mmol/K MgCl2
50mmol/L二硫苏糖醇
500μg/ml牛血清白蛋白(组分V.Sigma产品)(可用可不用)
该缓训液应分装成小份,贮存于-20℃。
    另外,再设立两个对照反应,其中含有(1)只有质粒载体;(2)只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足,每个连接反应可用50-100ng质粒DNA,并尽可能多加外源DNA,同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少3种不同方法来测定T4噬菌体DNA连接酶的活性。大多数制造厂商(除New England Biolabs公司外)现在都用Weiss等,11968)对该酶进行标化。1个Weiss单位是指在37℃下20分钏内催化1mmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需酶时,1个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位(Modrich和Lehman,1970)或者60个粘端单位(如New England Biolabs公司所定义)。因此,0.015Weiss单位的T4噬菌体DNA连接酶在16℃下30分钟内可使50%的λ噬菌体HindⅢ片段(5μg)得以连接。在本书中,T4噬菌体DNA连接酶一律用Weiss单位表示。\par 目前提供的T4噬菌体DNA连接酶均为浓溶液(1-5单位/μl),可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50%甘稀释成100单位/ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的T4噬体DNA连接酶于-20℃保存3个月可保持稳定。
3)每个样品各取1-2μl转化大肠杆菌感受态细胞。
(三)平端DNA连接

  T4噬菌体DNA连接酶不同于大肠杆菌DNA连接酶,它可以催化平端DNA片段的连接(Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978),由于DNA很容易成为平端,所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性,才能使任何DNA分子彼此相连。然而,相对而言,平端连接是低效反应,它要求以下4个条件:
1)低浓度(0.5mmol/L)的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981)。
2)不存在亚精胺一类的多胺。
3)极高浓度的连接酶(50Weiss单位.ml)。
4)高浓度的平端。
1.凝聚剂
  在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成集体的物质,如聚乙二醇(Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Harrison,1985)或氯化六氨全高钴(Rusche和Howard-Flanders,1985),可以使如何取得适当浓度的平端DNA的总是迎刃而解。在连接反应中,这些物质具有两作用:
1)它们可使平端DNA的连接速率加大1-3个数量级,因此可使连接反应在酶DNA浓度不高的条件下进行。
2)它们可以改变连接产物的分布,分子内连接受到抑制,所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样,即使在有利于自身环化(j:i=10)的DNA浓度下,所有的DNA产物也将是线状多聚体。\par 在设立含凝聚剂的连接反应时,下列资料可供参考。
(1)聚乙二醇(PEG8000)
1)用去离子水配制的PEG8000贮存液(40%)分装成小份,冰冻保存,但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15%PEG 8000的连接反应混合物中,对连接反刺激效应最为显著。除PEG 800和T4噬菌体DNA连接酶以外,其他所有连接混合物的组分应于0℃混合,然后加适当体积的PEG 8000(处于室温),混匀,加酶后于20℃进行温育。
2)连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著,甚至ATP浓度略有增加或MgCl2浓度略有降低,都会严重降低刺激的强度(Pheiffer和Zimmerman,1983)。
3)浓度为15%的PEG 8000可刺激带粘端的DNA分子的连接效率提高至原来的10-100倍,反应的主产物是串联的多联体。
4)PEG 8000可刺激短至8个核苷酸的合成寡聚物的平端连接,在这一方面,它与氯化六氨合高钴有所不同。
(2)氯化六氨合高钴
1)氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃,它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L时,其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部,但只能使端连接的效率提高到原来的5倍(Rusche和Howard-Flanders,1985)。
2)在单价阳离子(30mmol/L KCl)存在下,它对平端连接仍有一定的刺激作用,但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物,相反,环状DNA将点尽优势。
3)与PEG 8000不同,氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。

质粒DNA的分离、纯化和鉴定编辑本段回目录

  把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
  质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
  质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
  利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种,这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。
质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。
  质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性:(1)分子量小、多拷贝、松驰控制型;(2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点;(3)能插入较大的外源DNA片段;(4)具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间,如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。
  从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时,细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA,简称cccDNA)的两条链不会相互分开,当外界条件恢复正常时,线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。
  在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中,除了超螺旋DNA外,还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA);如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。 
材料、设备及试剂

   一、材料
  含pBS的E. coli DH5α或JM系列菌株,1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心管架。
  二、设备
  微量取液器(20μl,200μl,1000μl), 台式高速离心机,恒温振荡摇床, 高压蒸汽消毒器(灭菌锅), 涡旋振荡器, 电泳仪,琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等。
  三、试剂
  1、 LB液体培养基(Luria-Bertani) :称取蛋白胨(Tryptone)10 g,酵母提取物(Yeast extract) 5 g,NaCl 10 g,溶于800ml去离子水中,用NaOH调pH至7.5, 加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。
  2、LB固体培养基:液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。
  3、 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液:配成 50mg/ml水溶液, -20℃保存备用。
  4、 溶菌酶溶液: 用10mmol/L Tris•Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。
  5、 3mol/l NaAc (pH5.2): 50ml水中溶解40.81g NaAc•3H2 O,用冰醋酸调pH至5.2, 加水定容至100ml, 分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。
  6、 溶液Ⅰ:50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0), 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。
  7、溶液Ⅱ:0.2 mol/L NaOH (临用前用10mol/L NaOH母液稀释),1% SDS。
  8、溶液Ⅲ:5 mol/L KAc 60ml,冰醋酸 11.5ml, H2O 28.5ml,定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。
  9、RNA酶A母液:将RNA酶A溶于10mmol/L Tris•Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20℃。
  10、饱和酚:市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1%的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/L Tris•Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris•Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,因为酸性条件下DNA会分配于有机相。
  11、 氯仿:按氯仿:异戊醇=24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。   按体积/体积=1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性,操作时应戴手套。
  12、 TE缓冲液:10 mmo/L Tris•Cl (pH8.0),1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。
  13、STET:0.1 mol/L NaCl,10mmol/L Tris•Cl(pH8.0),10 mmol/L EDTA (pH8.0), 5% Triton X-100。
  14、STE:0.1mol/L NaCl,10mmol/L Tris•Cl(pH8.0),1mmol/L EDTA (pH8.0)。
  15、 电泳所用试剂: (1) TBE 缓冲液 (5×):称取 Tris 54g,硼酸27.5g,并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml,定溶至1000ml。 (2)上样缓冲液 (6×):0.25% 溴酚蓝,40% (w/v) 蔗糖水溶液。
操作步骤

   一、 细菌的培养和收集
  将含有质粒pBS的DH5α菌种接种在LB固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。
  二、 质粒DNA少量快速提取
  质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
  (一)、煮沸法
  1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。
  2、弃上清,将管倒置于卫生纸上几分钟,使液体流尽。
  3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
  4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
  5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
  6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
  7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
  8、取20ml进行电泳检查。
  [注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。
  2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。
  3. 提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。
  (二)、 碱法
  1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。
  2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。
  3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。
  4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口,快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。
  5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,并倒置离心管,温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。
  6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。
  7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟,然后4℃下12000g离心10分钟。
  8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70%乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g离心5-10分钟。
  9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。
  10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0,含20μg /ml RNaseA)中,储于-20℃冰箱中。
  [注意] 1. 提取过程应尽量保持低温。
  2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。
  3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。
  (三)、Wizard少量 DNA 纯化系统
  Promega公司的Wizard少量DNA纯化系统可快速有效的抽提质粒DNA,整个过程只需15分钟。提取的质粒可直接用于DNA测序、酶切分析和体外转录等。
  该系统中所含试剂和柱子可以用于50次1-3ml质粒培养液的分离和纯化,试剂包括10ml细胞悬浮液,10ml细胞裂解液;10ml中和液,50ml Wizard少量DNA纯化树脂,50ml柱洗液(使用前加95%乙醇至120ml )和50支Wizard微型柱。
  1、 1-3ml过夜培养细胞液4℃下 12000g离心1-2分钟。
  2、去除上清液,菌体细胞悬浮于200μl 细胞悬浮液中,充分混合,并移入eppendorf管中。
  3、 加200μl 细胞裂解液, 颠倒离心管数次,直到溶液变清亮。
  4、加200μl 中和液,颠倒离心管数次。
  5、4℃下12000g离心5分钟,取上清液于新的eppendorf管中。
  6、加1ml Wizard少量 DNA 纯化树脂,颠倒离心管数次以充分混匀。
  7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。
  8、将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2ml柱洗液,并用注塞轻推,使柱洗液进入微型柱。
  9、取出微型柱置于eppendorf管中,离心2分钟以除去微型柱中的柱洗液。
  10、将微型柱放在一个新eppendorf管中,加50μl TE(或水)于微型柱中,静止1分钟后,4℃下12000g离心20秒。
  11、丢弃微型柱,将eppendorf管中的质粒DNA贮于4℃或-20℃冰箱。
  [注意] 树脂使用前应充分混匀,如有结晶,可将树脂用25-37℃水浴处理10分钟。
  三、质粒DNA的大量提取和纯化
  在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
  (一)碱法
  1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml,4℃下5000g离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。
  2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中(此步可省略)。
  3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。
  4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中,充分悬浮菌体细胞。
  5、加入12ml新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴10分钟。
  6、加9ml用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。
  7、4℃下5000g离心15分钟。
  8、取上清液,加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37℃水浴20分钟。
  9、加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。
  10、取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。
  11、取上层水相,加入1/5体积的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分钟。
  12、4℃下12000g离心15分钟, 沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤,4℃下12000g离心5分钟。
  13、真空抽干沉淀,溶于500ml TE或水中。
  [注意] 1. 提取过程中应尽量保持低温。
  2. 加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡。
  3. 由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐热的特性,使用时应先对该酶液进行热处理(80℃ 1小时),使DNA酶失活。
  (二)Wazard大量DNA纯化系统
  碱法大量提取DNA往往需要很长的时间.Promega公司的Wiazrd大量DNA纯化系统既简单又快速,只需要离心和真空抽干,这个系统可以从500ml培养液中在3小时以内获得1mg以上的高质量的质粒DNA(200-20000bp)。该系统不需要酚和氯仿抽提,纯化后的DNA溶于水或TE缓冲液中,不含任何盐份,可以直接用于DNA序列分析和酶切反应,也可以用于在核酸酶抑制剂(如RNasin)存在的条件下进行体外转录反应等。
该系统中含有的试剂和柱子可以用于10次100-500ml质粒培养液的分离和纯化,试剂包括: 150ml 细胞悬浮液,150ml 细胞裂解液,150ml 中和液,100ml Wizard 大量DNA纯化树脂,125ml Wizard柱子洗脱溶液和10支 Wizard带有存储离心管的柱子。
  1、100-500ml细胞培养液置离心管中, 22-25℃下5000g离心10分钟, 所得细胞沉淀充分悬浮于细胞悬浮液中。
  2、 加15ml细胞裂解溶液并轻轻混合,可以反复倒置混合,但不能用涡旋振荡,细胞裂解完全时,溶液会变清,这一步需要20分钟。
  3、 加15ml中和溶液,立即反复倒置离心管数次,并使之混匀。
  4、 14000g,22-25℃离心15分钟。
  5、 小心地将上清液吸出并移至一个新离心管中。
  6、 加0.5倍体积的异丙醇,混合均匀, 14000g 22-25℃下离心15分钟。
  7、 弃上清,悬浮DNA沉淀于2ml TE缓冲液中。这一步中也许有的沉淀不能溶解。
  8、 加10ml Wizard大量DNA纯化树脂溶液, 并涡旋混合。
  9、每一个样品,使用一支Wizard大量柱子,柱子的头插在真空器上(Promega产品,与此配套)。
  10、将树脂/DNA混合液转入柱子中,真空抽取树脂/DNA混合液。
  11、将树脂/DNA混合液抽干后,加13ml柱子洗脱溶液至离心管中, 对管底部的树脂/DNA进行洗脱(柱子一边旋转一边加入洗脱液),并加入柱子中。
  12、真空抽干所加入的洗脱。
  13、 再加12ml柱子洗脱液进柱子并抽干。
  14、 加入5ml 80%乙醇漂洗柱中的树脂, 柱子真空抽干后将柱子放入用户提供的离心管中,2500rpm(1300g)离心5分钟。
  15、 取出柱子,真空抽干5分钟,再将柱子放入系统中所提供的离心管中,2500rpm(1300g)离心5分钟。
  16、在柱子中加入1.5ml 65-70℃预热过的灭菌重蒸水或TE,1分钟后2500rpm(1300g)离心柱子/离心管5分钟。
  17、 取出柱子,离心管中溶液即为提取的质粒DNA,可以直接放在离心管中,盖上盖子,储存在4℃或-20℃备用。
  [注意] 1. 在使用之前,系统所提供的柱子洗脱液按1:1加入125ml 95%乙醇。
  2. 纯化树脂必须混匀后再用.
  (三)Sephrose 2B柱纯化质粒DNA
  碱法提取的质粒DNA即使用RNA酶处理,仍会含有少量RNA。当有些试验需无RNA污染的DNA制品时,则需进行进一步纯化。一般常用Sepharose 2B或Sepharose 4B进行纯化,该方法具有快速,条件温和,重复性好,载体物质可以再利用等优点,因而已广泛用于质粒DNA纯化。
  1、将Sepharose 2B经含0.1% SDS的TE(pH8.0)平衡后上柱。
  2、将至多1ml的DNA溶液铺在Sepharase 2B柱上。
  3、待DNA溶液完全进入柱内后立即在柱的上部连接含有0.1% SDS的TE(pH8.0)贮液瓶。
  4、以1ml流出液为1份进行收集。
  5、对每一管测定其OD260值,以确定哪些管中含有质粒DNA。通常质粒DNA在柱上流出的第一个峰中。
  6、合并所有含质粒的洗脱液,用等体积的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下12000g离心2分钟,将上层水相转入新管。
  7、加入2倍体积的冰冷无水乙醇,-20℃下沉淀10分钟,然后4℃下12000g离心10分钟,弃去上清液。
  8、沉淀加70%乙醇洗涤,4℃下12000g离心10分钟,弃去上清液。
  9、 沉淀真空抽干,重新溶于TE或无菌水中。
  [注意] 在装柱过程中,要防止柱床中出现断裂或气泡现象,要使界面保持平整。对新装成的柱,应用含0.1%   SDS的TE平衡, 以使柱内的凝胶均匀。

DNA酶切及凝胶电泳编辑本段回目录

  一. DNA的限制性内切酶酶切分析
  限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA,而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用,它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

  5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'
  3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'

  DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后,用等体积酚/氯仿抽提,加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇,混匀后置-70℃低温冰箱30分钟,离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。
  DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱,它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成,以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中,建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节,近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。
  构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶,通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。
  在酶切图谱制作过程中,为了获得条带清晰的电泳图谱,一般DNA用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。
  二. 凝胶电泳
  琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速,可以分辨用其它方法(如密度梯度离心法)所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, E 染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。
  琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。
  琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:
  1、 DNA的分子大小:
  线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢。
  2、 琼脂糖浓度
  一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
  3、 DNA分子的构象
  当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。
  4、 电源电压
  在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。
  5、嵌入染料的存在
  荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15%。
  6、 离子强度影响
  电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
  对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。
材料、设备及试剂

  一、 材料
  λDNA: 购买或自行提取纯化; 重组pBS质料或pUC19质粒; EcoRI酶及其酶切缓冲液: 购买成品; HindⅢ酶及其酶切缓冲液: 购买成品;琼脂糖(Agarose): 进口或国产的电泳用琼脂糖均可。
  二、 设备
  水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 照相支架, 照相机及其附件。
  三、 试剂
  1、 5×TBE电泳缓冲液:配方见第一章。
  2、 6×电泳载样缓冲液:0.25% 溴粉蓝,40%(w/v) 蔗糖水溶液,贮存于 4℃。
  3、 溴化乙锭(E 溶液母液:将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于 室温即可。
操作步骤

  一、 DNA酶切反应
  1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl,将管内溶液混匀后加入1μl酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加,漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间,以免活性降低。
  2、 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上(如插在泡沫塑料板上),37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。
  3、 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。
  二、DNA分子量标准的制备
  采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段来作为电泳时的分子量标准。λDNA为长度约50kb的双链DNA分子,其商品溶液浓度为0.5mg/ml,酶解反应操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8个片段,长度分别为23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6个片段,长度 分别为21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和2.5kb。
  三、 琼脂糖凝胶的制备
  1、 取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。
  2、 胶液的制备:称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
  3、 胶板的制备:将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。
向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(E 溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
  4、 加样:取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
  5、 电泳:加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。
  6、 染色:未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。
  7、 观察和拍照:在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。 经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上,采用全色胶片,光圈5.6,曝光时间10-120秒(根据荧光条带的深浅选择)。
  8、 DNA分子量标准曲线的制作:在放大的电泳照片上,以样品槽为起点,用卡尺测量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标,以迁移距离为横坐标,在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线,即为该电泳条件下DNA分子量的标准曲线。
  9、 DNA酶切片段大小的测定:在放大的电泳照片上,用卡尺量出DNA样品各片段的迁移距离,根据此数值,在DNA分子量标准曲线上查出相应的对数值,进一步计算出各片段的分子量大小(若用单对数坐标纸来绘制标准曲线,则可根据迁移距离直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。
  10、 DNA酶切片段排列顺序的确定:根据单酶切,双酶切和多酶切的电泳分析结果,对照DNA酶切片段大小的数据进行逻辑推理,然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环状图或直线图表示,即成该DNA分子的限制性内切酶图谱。
  [注意] 1.酶切时所加的DNA溶液体积不能太大,否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。
  2、酶活力通常用酶单位(U)表示,酶单位的定义是:在最适反应条件下,1小时完全降解1mg lDNA的酶量为一个单位,但是许多实验制备的DNA不象lDNA那样易于降解,需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的,除考虑成本外,酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。
  3、市场销售的酶一般浓度很大,为节约起见,使用时可事先用酶反应缓冲液(1×)进行稀释。另外,酶通常保存在50%的甘油中,实验中,应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下,否则,酶活性将受影响。
  4、 观察DNA离不开紫外透射仪,可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm),以减少紫外光切割DNA。
  5、 EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
  6、 当EB太多,胶染色过深,DNA带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡,30分钟后再观察。

质粒DNA的提取与电泳鉴定编辑本段回目录


质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术,但提取方法有很多种,以下介绍一种最常用的方法:
碱裂解法:此方法适用于小量质粒DNA的提取,提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下:
1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管,以4000rpm离心3min,弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1%葡萄糖,50mM/L EDTA pH8.0,25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH,1% SDS),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc,pH4.8),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min 。
7、以10,000rpm离心20min,取上清液于另一新Ep管
8、加入等体积的异戊醇,混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10,000rpm离心20min,弃上清。
10、用70%乙醇0.5ml洗涤一次,抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后,溶于0.05mlTE缓冲液中

煮沸法
1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。
2、弃上清,将管倒置于卫生纸上几分钟,使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。

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质粒DNA的大量提取和纯化(碱法)编辑本段回目录


在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml,4℃下5000g离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。
2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中(此步可省略)。
3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。
4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中,充分悬浮菌体细胞。
5、加入12ml新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴10分钟。
6、加9ml用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。
7、4℃下5000g离心15分钟。
8、取上清液,加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37℃水浴20分钟。
9、加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。
10、取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。
11、取上层水相,加入1/5体积的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分钟。
12、4℃下12000g离心15分钟, 沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤,4℃下12000g离心5分钟。
13、真空抽干沉淀,溶于500ml TE或水中。

 质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定
琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物,应选用电泳纯的,琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶,而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。
(1)琼脂糖凝胶电泳装置
由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高,而适应性又强,在过去20年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。使用最普遍的装置是Walter Schaffner发明的水平板凝胶。
水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中,则可将凝胶直接铺在平台上。凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同,所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。
(2)琼脂糖凝胶的制备
琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中,令其固化。凝固后,琼脂糖形成一种固体基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。通贯凝胶的电场接通后,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。
(3)琼脂糖凝胶的染色
电泳完毕,将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中,染色10分钟,取出紫外灯下观察。

 线形质粒DNA 5'-粘性末端去磷酸
经限制性内切酶酶切的质粒DNA 5'端均带有磷酸集团,如用此载体直接转化大肠杆菌,其自身环化几率非常高,影响连接、转化效率。因此一般酶切的质粒DNA要经脱磷,使用碱性磷酸酶(CIAP)去除5'端磷酸集团。方法如下:
1、质粒DNA和CIAP以及BUFFER 37℃水浴30min
2、补充CIAP 再37℃水浴30min
3、加入50mM EDTA至终浓度5mM 75℃加热10min 失活CIAP
4、冷却至室温,酚-氯仿抽提,乙醇沉淀浓缩。
5、抽干溶液,加适量TE溶解。

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RNA的提取和cDNA合成编辑本段回目录

   从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自70年代中叶首例cDNA克隆问世以来,已发展了许多种提高cDNA合成效率的方法,并大大改进了载体系统,目前cDNA合成试剂已商品化。cDNA合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,加入合成接头以及将双链DNA克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。
  一、RNA制备
  模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染,因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换(使用一次性手套)。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。除DEPC外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。
  细胞内总RNA制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。分离的总RNA可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特点,当RNA流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
  二、cDNA第一链的合成
  所有合成cDNA第一链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应。目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。AMV反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基,这些活性包括依赖于RNA的DNA合成,依赖于DNA的 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。MLV反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性,但降解RNANA杂交体中的RNA的能力较弱,且对热的稳定性较AMV反转录酶差。MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反转录酶和MLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的最适pH值,最适盐浓度和最适温室各不相同,所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。
  AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3'端poly(A)结合的12-18核苷酸长的oligo(dT)。
  三、cDNA第二链的合成
  cDNA第二链的合成方法有以下几种:
  (1) 自身引导法 合成的单链cDNA 3'端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反转录酶合成cDNA第二链,最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应,而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5'端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用。
  (2) 置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链不用碱变性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。该反应有3个主要优点: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和纯化; (3) 不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。目前合成cDNA常采用该方法。
  四、cDNA的分子克隆
  已经制备好的双链cDNA和一般DNA一样,可以插入到质粒或噬菌体中,为此,首先必需连接上接头(Linker),接头可以是限制性内切酶识别位点片段,也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。合成的cDNA也可以经PCR扩增后再克隆入适当载体。

附:动植物组织mRNA提取
  一、材料
  水稻叶片或小鼠肝组织。
  二、设备
  研钵,冷冻台式高速离心机,低温冰箱,冷冻真空干燥器,紫外检测仪,电泳仪,电泳槽。
  三、试剂
  1、无RNA酶灭菌水:用将高温烘烤的玻璃瓶(180℃ 2小时)装蒸馏水,然后加入0.01%的DEPC(体积/体积),处理过夜后高压灭菌。
  2、75%乙醇:用DEPC处理水配制75%乙醇,(用高温灭菌器皿配制),然后装入高温烘烤的玻璃瓶中,存放于低温冰箱。
  3、1×层析柱加样缓冲液;20mmol/L Tris•Cl(pH7.6),0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTA(pH8.0),0.1% SDS。
  4、洗脱缓冲液:10mmol/L Tris•Cl (pH7.6),1mmol/L EDTA (pH8.0),0.05% SDS。
  四、操作步骤
  (一)动植物总RNA提取-Trizol法
  Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析,斑点杂交, Poly(A)+分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆。
  1、将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
  2、研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。
  3、取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。
  4、弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500g离心5分钟。
  5、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中,必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
  [注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。
  2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。

  (二)mRNA提取
  由于mRNA末端含有多poly(A)+,当总RNA流径oligo(dT)纤维素时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA可被洗下,经过两次oligo(dT) 纤维素柱,可得到较纯的mRNA。
  1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。
  2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床体积为0.5-1.0ml,用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。
  3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床,直到流出液的pH值小于8.0。
  4、将(一)中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温,加入等体积2x柱层析缓冲液,上样,立即用灭菌试管收集洗出液,当所有RNA溶液进入柱床后,加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。
  5、测定每一管的OD260,当洗出液中OD为0时,加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液,以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。
  6、测定OD260,合并含有RNA的洗脱组分。
  7、加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2), 2.5倍体积的冰冷乙醇, 混匀, -20℃30分钟。
  8、4℃下12000g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗 涤沉淀,4℃下12000g离心5分钟。
  9、小心弃去上清液,沉淀空气干燥10分钟,或真空干燥10分钟。
  10、用少量水溶解RNA液,即可用于cDNA合成(或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃)。
  [注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
  2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净,然后用层析柱加样缓冲液平衡,并加入0.02%叠氮钠(NaN3)冰箱保存,重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。
附:植物病毒RNA提取
  大多植物病毒RNA为单链RNA,并且其极性与mRNA极性相同,植物病毒RNA提取较为简单,一般使用酚氯仿即可获得满意结果。
  一、材料
  提纯TMV病毒液(10mg/ml)。
  二、设备
  冷冻台式离心机,低温真空干燥仪,电泳仪,电泳槽。
  三、试剂
  TE-饱和酚:氯仿(1:1),氯仿,3M NaAc(pH5.2),乙醇(100%和70%),TE缓冲液,无RNA酶的双菌水。
  四、操作步骤
  1、取一eppendorf管加入提纯TMV(10mg/ml)400ml,再加入等体积酚/氯仿,盖紧管盖后用手充分振荡1分钟,4℃下12000g离心10分钟。
  2、吸取水相于一新eppendorf管,再用酚/氯仿抽提,直至水相和有机相交界面无蛋白为止。
  3、吸取水相于新eppendorf心管,加入等体积氯仿,用手倒置离心管数十秒,4℃下12000g离心10分钟。
  4、取水相,加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH5.2),2.5倍体积的冰冷乙醇,混匀,-20℃30分钟。
  5、4℃下12000g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗涤沉淀,4℃下12000g离心5分钟。
  6、小心弃去上清液,沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟,并溶于无RNA酶的双菌水或TE缓冲液中。
  7、取10ml进行电泳分析,另10ml用于cDNA合成。
  [注意] 1、整个操作应尽可能在低温下进行。
  2、由于病毒RNA镶嵌于外壳蛋白里面,因此要充分剥去病毒外壳蛋白,一般需要多次进行酚/氯仿的抽提。

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  一、 Riboclone M-MLV(H- ) cDNA合成技术
  Promega公司的RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA合成系统采用M-MLV反转录酶的RNase H缺失突变株取代AMV反转录酶,使合成的cDNA更长。该系统的第一链合成使用M-MLV反转录酶,cDNA第二链合成采用置换合成法,采用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ进行置换合成,最后用T4 DNA聚合酶切去单链末端,方法简便易行。该系统试剂包括:
  20μg 特异性引物
  200μl M-MLV第一链缓冲液(5×),配方如下: 250mmol/L Tris•Cl pH8.3(37℃时); 375mmol/l KCl;      15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP混合物(各2.5mmol/L)
  2×625μ rRNasinR RNA酶抑制剂
  10,000μ M-MLV反转录酶, RNase H-
  5μg 对照RNA
  400μl M-MLV第二链缓冲液(10×),配方如下:
    400mmol/L Tris•Cl ,pH7.2; 850mmol/L KCl; 44mmol/L MgCl2;
    30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。
  500μ RNase H
  500μ DNA聚合酶Ⅰ
  100μ T4 DNA聚合酶Ⅰ
  2×1.25ml 不含核酸酶的水
  以上所有试剂除对照RNA需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40μg mRNA。

  (一) 第一链合成
  1. 试剂
  [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol),EDTA (50mM和200mM),TE-饱和酚:氯仿(1:1),7.5M NH4Ac,乙醇(100%和70%),TE缓冲液。
  2. 操作步骤
  (1) 取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管,加入RNA模板和适当引物,每μg RNA使用0.5μg引物(如使用NotⅠ引物接头,使用0.3μg),用H2 O调整体积至15μl, 70℃处理5分钟,冷却至室温,离心使溶液集中在管底,再依次加入
   5×第一链缓冲液 5μl
   rRNasin RNA酶抑制剂 25U
   M-MLV(H- )反转录酶 200U
   H2 O 调至总体积25μl
  (2) 用手指轻弹管壁,吸取5μl至另一eppendorf管,加入2-5μCi [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol),用以第一链同位素掺入放射性活性测定。
  (3) 37℃(随机引物)或42℃(其它引物)温浴1小时
  (4) 取出置于冰上
  (5) 掺入测定的eppendorf管加入95μl 50mM EDTA终止反应,并使总体积为100μl。可取90μl进行电泳分析(先用苯酚抽提),另10μl进行同位素掺入放射性活性测定。
   第一链合成eppendorf管可直接用于第二链合成
  注:以上25μl反应总体积中所用RNA量为1μg,如合成5μg RNA,则可按比例扩大反应体积, 倒5μg RNA使用125μl总体积进行合成。

  (二) 第二链合成
  1、 取第一链反应液 20μl, 再依次加入
    10×第二链缓冲液 20μl
    DNA聚合酶Ⅰ 23μ
    RNase H 0.8μ
    H2O 加至终体积为100μl
  2、轻轻混匀,如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定,可取出10μl至另一eppendorf管,加入2-5μCi[α-32 P] dCTP。
  3、14℃温浴2小时(如需合成长于3kb的cDNA, 则需延长至3-4小时)。
  4、 掺入测定eppendorf管中加入90μl 50mM EDTA, 取10μl进行同位素掺入放射性测定,余下的可进行电泳分析。
  5、 cDNA第二链合成离心管反应液70℃处理10分钟, 低速离心后置冰上。
  6、 加入2μ T4 DNA聚合酶, 37℃温浴10分钟。
  7、加入10μl 200mmol/L EDTA终止反应。
  8、用等体积酚:氯仿抽提cDNA反应液,离心2分钟。
  9、水相移至另一eppendorf管,加入0.5倍体积的7.5M醋酸铵(或0.1倍体积的1.5M醋酸钠,pH5.2), 混匀后再加入2.5倍体积的冰冷乙醇(-20℃), -20℃放置30分钟后离心5分钟。
  10、 小心丢去上清液,加入0.5ml冰冷的70%乙醇,离心2分钟。
  11、 小心移去上清液,干燥沉淀。
  12、 沉淀溶于10-20μl TE缓冲液。

cDNA文库构建标准流程编辑本段回目录

一.Total RNA的提取
1.试剂配制
准备工作:
1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部,置于烤箱内,180℃,烤6小时。
2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后,121℃ 20mins 高压灭菌。
3、 电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。
4、常用试剂及其配方:
▲DEPC水:在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。
▲0.78M柠檬酸纳:PH=4~5
三水合柠檬酸纳    22.94g
加DEPC水定容至100ml,室温放置备用。
 
▲10%肌氨酸钠:
肌氨酸钠           10g
加DEPC水定容至100ml,室温放置备用。              
                    
▲变性裂解液:                 
0.78M柠檬酸钠    8.25ml
10%肌氨酸钠      12.375ml
异硫氰酸胍        118.05g
加DEPC水定容至  250ml,室温放置备用
                  临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%(v/v)

▲ 2M 醋酸钠    PH=4.5
            NaAc•3H2O        13.6g
加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用
                                           
▲3M醋酸钠     PH=5
            NaAc•3H2O        20.4g
            加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用
▲ 4M LiCL:
                LiCL               24.164g
                    加DEPC水定容至100ml,高压灭菌,室温放置备用

▲0.5M EDTA  PH=8.0
                    EDTA              18.61g
用NaOH调PH值至8.0,定容到100ml,高压灭菌,室温放置备用                
    ▲10X  MOPS (3-(N-吗啉代)丙磺酸):
                  MOPS              41.86g
NaAC•3H2O        4.10g
0.5MEDTA(PH 8.0) 20ml
用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L,室温避光放置备用。
▲ 1x  MOPS:
10x  MOPS         30ml
加DEPC水270ml,用时现配。

▲4x RNA  Loading  buffer:
                  10x MOPS                 400ul
                  甘油(高压过)            200UL
                  溴酚兰                    10ul
                  甲醛(37%)                 72ul
                  去离子甲酰氨             310ul
                  EDTA(0.5M  PH 8.0)        8ul
                  ErBr(10mg/ml in DEPCH2O)   70ul
                  在4℃ 可保持3个月
▲ 10x PBS
pH=7.4
NaCl    80g
KCl     2g
Na2HPO4   14.4g
KH2PO4    2.4g
定容至     1000ml
▲变性电泳胶:
称取0.5g琼脂糖,加入47.5ml 1x MOPs,加热至琼脂糖熔化后,冷却至50℃左右,加入2.5ml甲醛,轻轻混匀后倒入电泳托上。
▲变性电泳缓冲液:
在250ml容量瓶内加入5ml甲醛,用1x MOPS定容至250ml

2.动物组织total RNA的提取
1. 根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量,将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中,冰浴5分钟。
2. 将组织样品放入变性裂解液中,在高速下匀浆15-30秒/次,直到看不见组织和细胞碎片。
3. 根据表1加入适量2M的乙酸钠(pH4.0),反复颠倒混匀4-5次。
4. 根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟。
5. 冰浴10分钟。
6. 4C,12000g离心20分钟。
7. 小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,内含所需的RNA。蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层。
8. 加入等体积的异丙醇,-20C沉淀30分钟以上。
9. 4C,12000g离心20分钟。
10. 根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。
11. 加等体积的氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟。
12. 4C,12000g离心20分钟。
13. 小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇,-20C沉淀至少30分钟。
14. 4C,12000g离心20分钟。
15. 弃上清,加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。4C,12000g离心10分钟。
16. 弃上清,空气中干燥RNA沉淀,直至没有乙醇气味。用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。
17. 取少量RNA用于测定OD值及电泳,其余置-80C冰箱中保存。

Mg# of tissue 500 800 1000
变性裂解液(ml) 5 8 10
2M NaOAC pH 4 (ml) 0.5 0.8 1
水饱和酚 (mL) 5 8 10
氯仿 (mL) 1 1.6 2
异丙醇(mL) 4 6 8
变性裂解液 (mL) 0.5 0.8 1
异丙醇(mL) 0.5 0.8 1
75% 乙醇(mL) 1 1 1
DEPC-treated H20 (mL) 0.5 0.8 1

3.植物组织total RNA的提取
1. 先将研钵于-80℃冰箱中预冷,然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。
2. 将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中,充分匀浆。(1g样品加入3ml变性裂解液)。
3. 加入0.3ml(1/10体积)2M的NaAc(ph4-5)颠倒混匀。
4. 加入3ml(等体积)的水饱和酚,充分振荡,再加入1ml(1/3)的氯仿,振荡。
5. 冰浴10min。4℃,12000g离心10min
6. 小心转移上清于另一离心管中,加入2倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀至少1小时。
7. 4℃,12000g离心20min。
8. 去上清,取沉淀。加1ml 4M的LiCl 溶解沉淀(1mlLiCl/g组织),并转入1.5ml离心管中。
9. 4℃,13000rpm离心15min。
10. 用0.4ml DEPC水溶解沉淀,加1/2体积的水饱和酚,1/2体积的氯仿,颠倒混匀。
11. 4℃,13000rpm离心10min。
12. 取上清,加1/10体积的3MNaAc(ph5)和2倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。
13. 4℃,13000rpm离心15min。
14. 弃上清,用1ml 75%的乙醇洗涤沉淀,4℃,13000rpm离心10min。
15. 弃上清,取沉淀,空气中干燥RNA沉淀,直至无乙醇味。
16. 用40-60ul DEPC水溶解(300-500ug/g)RNA沉淀。
17. 取少量RNA用于测定OD值及电泳,其余置-80℃冰箱中保存。
4. TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO)
1. 查表根据样品量选择适当的 TRIzol Reagent体积装入50ml RNase-free离心管中,注意样品体积不能超过TRIzol Reagent体积的10%。
2. 将组织样品放入TRIzol Reagent中,高速下匀浆15-30秒/次,直至看不见组织和细胞碎片。
3.室温温育10分钟 。
4. 据表2加入适量体积的氯仿,剧烈震荡15秒钟,然后室温下温育3分钟。
5. 4ºC,12000g离心15分钟,形成淡红色的苯酚/氯仿有机相,中间相和上层水相,水相约占TRIzol体积的60%。
6. 转移上清于另一个Rnase-free的 50ml离心管中。根据表2加入适量异丙醇,-20ºC沉淀1小时以上。
7. 4ºC,12000g离心10分钟。
8. 去上清,据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。
9. 4ºC,7500g离心5分钟。
10. 去上清,空气中干燥或真空抽干RNA沉淀,但不要太干。加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀。
11. 取少量RNA用于测定其OD值和电泳,其余置-80ºC冰箱中保存。
组织量 TRIzol Reagent 氯仿 异丙醇 75%乙醇
50~100mg 1ml 0.2ml 1ml 1ml
二.mRNA的分离
1.Oligotex mRNA Kits  (QIAGEN)法
 准备工作:
1.将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中,旋转混匀,溶解Oligotex.,然后置于室温。
2.将OBB Buffer置于37℃水浴中,旋转混匀,重溶沉淀物,然后置于室温。
3.将OEB Buffer 置于70℃水浴中,待用。

试验步骤:
表:加入试剂量据此表
Total RNA RNase-free Water to: Buffer OBB
(ul) Oligotex
Suspension  (ul) Prep size
<=0.25mg 250ul 250ul 15 Mini
0.25-0.5mg 500ul 500ul 30 Midi
0.5-0.75mg 500ul 500ul 45 Midi
0.75-1.00mg 500ul 500ul 55 Midi

1. Total RNA 量不要多于1mg,用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中,加RNase-free water 补足到500ul
2. 根据表3加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension, 轻弹1.5ml离心管彻底混匀
3. 置于70℃水浴中3min
4. 取出置于室温(20℃-30℃)10min
5. 13000rpm室温离心 2min,用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中,保留上清直到polyA被结合上。
6. 用移液器取400ul OW2 Buffer混匀沉淀物,将混合物转移到 Spin Column中,RT ,13000rpm,离心1min
7. 将Spin Column 转移到一个新的1.5ml离心管中,加400ul OW2,RT,  13000rpm,离心1min
8. 将Spin Column 转移到一个新的1.5ml管中,取出25ulOER Buffer(70℃)到Column中,用移液器吹打3-4次树脂,室温 13000rpm,离心1min。
9. 取出25ul OER Buffer(70℃)到Column中,用移液器吹打3-4次树脂,室温 13000rpm,离心1min。
10. 测OD,并电泳定量。
2.磁珠法分离mRNA
1. 在RNase-free的Eppendorf 管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul.
2.  65ºC加热10分钟。
3. 加入3ul生物素标记的Oligo(dT)和13ul 20×SSC于RNA中,轻轻混合,室温放置逐渐冷去至室温,一般需10 分钟左右。
4. 同时配0.5×SSC 1.2ml和0.1×SSC 1.4ml.
5. 将磁珠(SA-PMPs)轻晃散开,放入磁性分离架上,使SA-PMPs集中于管的一侧(约30sec),小心去上清,切不可离心。用0.3ml 0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠,去除上清,重复3次。
6. 将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml 0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内使用。
7. 将(3)中的oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA—PMPs管中,轻轻摇匀,室温下放10 分钟。
8. 用磁性分离架捕获SA-PMPs,小心去上清,但不要弃去。
9. 用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次,每次都晃至SA-PMPs悬浮,最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相,而不损坏SA-PMPs.
10. 将SA-PMPs重新悬浮在0.1ml RNase-free水中,反复颠倒,使SA-PMPs散开,洗脱mRNA。
11. 用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中。
12. 将SA-PMPs再悬浮于0.15ml RNase-free的水中,洗脱,与(11)步洗脱液合并。
13. 将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳,若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录,则需将得到的mRNA溶液浓缩(浓缩步骤见14-18)。
14. 加0.1体积的3mol/l NaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中,-20ºC沉淀过夜。
15. 4ºC,13000g离心60 分钟。去上清,加入500ul 70%乙醇混匀。
16. 4ºC,7500g离心10 分钟。
17. 去上清,真空或空气中自然风干,但不要太干,加适量RNase-free水溶解。
18. 重复步骤5-12,将步骤8保留下的样品重新上柱

注意事项:
1.所有操作均需要严格戴手套,戴口罩进行
2.如果total RNA质量高,杂质少,就选择Oligotex的方法分离mRNA,相反则可以用磁珠法。
3.mRNA的电泳图是smear。

三.cDNA双链合成
1. Superscipt II—RT合成第一链:
1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入
         xul   mRNA(大约500ng)
         1ul   Xho I Primer(1.4ug/ul)
           (5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)
         11-x ul   RNase-free water
(大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.)
2. 混匀后,70℃反应10分钟;
3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;
4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:                          
4ul  5×first strand buffer
2ul   0.1M DTT
1ul  10mM dNTP(自己配制)
5. 混匀,稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀;
7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.

2. cDNA第二链的合成:
1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物-20℃冰箱中保存,待电泳检测。其余的产物合并,混匀,然后顺序加入下列试剂(promega):
20ul   10×DNA Polymerase I buffer
6ul    10mM dNTP(自己配制)
xul    dd H2O
1ul    RNase H(2U/ul)
10ul   DNA Polymerase I(10U/ul)
总体系为200ul;
2. 混匀后,16℃反应2.5小时;
3. 70℃灭活10分钟;
4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;
5.取2ul二链产物,同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder,确定双链的大小范围。
注:一链,二链的电泳图是smear,且二链稍比一链大一些。
3. 双链cDNA末端补平:
1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):
6ul   10mM dNTP
2ul   T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)
                   2ul   BSA(10mg/ml)
2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;
3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
注:第3,第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
PCR纯化试剂盒操作流程:
1.溶液PE使用前应加入适量体积95%-100%的乙醇,混匀。
2.向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB,混匀。
3.加入spin column中,13000rpm离心1min。
4.加入0.75ml buffer PE,13000rpm离心1min。
5.13000rpm,再离心1min。
6.将spin column放入一新的离心管中,加入50ul buffer EB,静置10min。
7.13000rpm离心2min。
8.加入30ul buffer EB,静置10min。
9.13000rpm离心2min。
10.加入1/10体积3M的NaAc,2.5倍体积无水乙醇,混匀,-20℃沉淀过夜。
4 EcoR I adaptor 加接:
1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;
2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:
                1.2ul   10×Ligase Buffer
1ul    10mM rATP
1 ul    T4 DNA Ligase(4U/ul)
3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;

5双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切:
1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA  Ligase;
2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:
1ul   10×Ligase Buffer
1ul   10mM rATP
6ul   dd H2O
1ul   T4 PNK(10U/ul)
3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;
4. 稍微离心使反应物集中至管底;
5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:
4ul   Xho 10×Buffer
2ul   BSA
5ul   ddH2O
8ul    Xho I (10U/ul)
6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;
7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。

6.胶回收cDNA(QIAEXII GEL Extraction Kit 回收试剂盒)
1. 配制小胶数板(每个样品一板):1%琼脂糖凝胶,2ul EB/300ml 胶
2. 取4℃保存样品上样,40ul/孔。
3.电泳50V;1hr
4.紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.,分别放入已做标记的1.5ml离心管中。
5. 称取胶重,加入三倍体积buffer QXI(例如,100mg胶中加入300ul buffer QXI)
6. 50℃ 水浴数分钟,至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬,每管中加入5ul QIAEXII
7. 50℃ 水浴10min,每隔2min 取出颠倒混匀数次,使QIAEX II 保持悬浮
8. 4℃,13000rpm,30sec。(弃上清,离心机中甩一下,吸取上清)
9. 加入500ul buffer QXI,轻弹管底使QIAEX II 重悬
10. 离心并去上清(同操作8)
11. 加入500ul buffer PE,重悬QIAEX II,离心30sec,去上清
12. 再加入500ul buffer PE,重悬QIAEX II,离心30sec,弃上清,离心机中甩一下,吸去上清
13. 超净台上吹干(至无乙醇味),加入10ul elution buffer,重悬QIAEX II,静置5min,13000rpm,30sec。吸上清,冰上放置。
14. 取1ul上清上样电泳,同时做分子量标准(1kb ladder)及DNA含量标准(10ng,20ng)作对照。
15. 将收回的cDNA置于-20℃内保存,据电泳结果,取适量DNA进行连接。

注意事项:
1.胶回收前电泳槽,电泳板,梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。
2.胶回收时电压要稳定。

四.载体制备
1.pBlueScriptII的提取
1.取1ul商品的pBlueScriptII,转化入大肠杆菌宿主菌中,取5ul转化产物均匀涂布在含AMP的LB平板上,37℃培养过夜。
2.第二天取一只无菌的50ml离心管,加入10ml AMP抗性的LB液体培养基,挑单克隆于离心管中,37℃,250rpm,培养过夜。
3.第三天取200µl小摇后的菌液接种于250ml 含AMP的LB液体培养基中,37℃,250rpm培养6 hr左右,使OD值达到0.6-0.8。
4.将菌液移入250ml离心管中, 4℃,3000rpm,离心15min。取出离心管,菌团朝上倒掉上清,将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干。(注意离心前需配平)
5.加入10ml溶液Ⅰ(50mM Glucose , 25mM Tris-HCl,10mM EDTA, pH8.0),加入RNase至终浓度100µg/ml,晃动摇菌,使菌体充分悬浮,静置10min。
6.按NaOH(0.4N):SDS(2%)--1:1的比例新鲜配制溶液Ⅱ,加入20ml溶液Ⅱ,静置3-5min。
注: 静置时间勿超过5min,提前将溶液Ⅲ置于冰盒中。
7.加入15ml冰浴的溶液Ⅲ,冰浴15-30min。
8.4℃,5000rpm,离心15min。
9.取上清于两个50ml离心管中,弃去原离心管中的沉淀。
10.每管加入0.6倍体积的异丙醇,充分混匀,室温下放置10min。
11. 20℃,12000g,离心20min回收质粒沉淀。
12.弃上清,用70%的乙醇洗2次。
13.弃上清,倒扣于吸水纸上,尽量空干液体。
14.用3ml TE(pH8.0)溶解沉淀,移入1.5ml Eppendorf离心管中。
15.电泳检查DNA质量并定量。(必要的话,可以用胶回收的方法先纯化一下质粒再进行双酶切。)
2.pBlueScriptII的双酶切消化
1.以如下体系进行EcoRI酶切:
pBSK(+)                   X µl(6µg)
ddH2O                     174-X µl
10×Buffer E                20 µl
混匀,加入限制性内切酶:
         EcoRI (10U/ µl)            6 µl  
    总体积为200 µl。
2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩一下。
3.37℃,水浴1hr。
4.加入200ul 1:1的酚/氯仿,混匀。4℃,13000rpm,离心15min。
5.取上清,加入等体积的氯仿,4℃,13000rpm,离心10min。
6.取上清,加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇,-20℃,沉淀30min。
7. 4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀。
8.加入200ul 70%的乙醇洗沉淀。
9.4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀。
10.自然风干沉淀,至无乙醇味,加入100ul ddH2O充分溶解沉淀。
11.加入以下试剂进行XhoI酶切:
  ddH2O                   74 µl
10×Buffer D               20 µl
混匀,加入限制性内切酶XhoI:
            XhoI (10U/ µl)         6 µl  
总体积为200 µl。
12.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩一下
13.37℃,水浴1.5hr。
14.加入200ul 1:1的酚/氯仿,混匀。
15.4℃,13000rpm,离心15min。
16.取上清,加入等体积的氯仿,4℃,13000rpm,离心10min。
17.取上清,加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇,-20℃,沉淀30min。
18. 4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀。
19.加入200ul 70%的乙醇洗沉淀。
20.4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀。
21.自然风干沉淀至无乙醇味,加入40ulddH2O充分溶解沉淀,得到双酶切载体。
3.载体去磷酸化
1.在40ul双酶切载体中加入以下试剂:
              6ul   10×buffer
              6ul     CIAP(0.01U/ul)
              8ul    ddH2O
   总体积60ul。
2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩一下。
3.37℃,水浴1hr。
4.70℃,15min,灭活酶。
5.电泳分离,胶回收双酶切载体,定量。
4.载体效率检测
1. 按以下所示作4个连接反应:
      
     DNA 连接酶
1 pBlueScriptII/E/X /CIAP    - 检测酶切效率
2 pBlueScriptII/E/X /CIAP    + 检测脱磷效率,载体自连效率
3 商品Vector加标准Insert    + 对照
4 自制Vector加标准Insert    + 检测载体效率
14℃连接过夜。
2. 各取1ul连接产物作电转化(具体流程见电转化)
3. 计算克隆数,计算载体相对脱磷效率及连接效率。
五.cDNA双链和载体的连接
1.连接:
根据载体和cDNA的电泳定量结果,每个样品设置3个比例的连接,
即:insert/vector=1/3  incert/vector=1/1   insert/vector=3/1
按以下体系依次加入:
      ddH2O                      xul
T4 ligase 10x buffer       1ul
PBK(E/X)vector(20ng/ul)    1ul
cDNA                      (由浓度及连接比例而定)
T4 DNA ligase(3U/ul)       1ul
 Total                      10ul
14℃,连接过夜
2.检测:(PCR方法)
取适量PCR薄壁管,置于冰上,按以下体系依次加入:
               连接产物  insert  vector  阳性对照   阴性对照(H20)
模板:            1         1      1        1           1
10xbuffer        2.5       2.5    2.5      2.5         2.5     
Mgcl2(25mM)       1.8       1.8    1.8      1.8         1.8
DNTP(2.5mM)        1         1      1       1            1
T3 引物(10pmol)  1         1      1       1            1       
T7 引物(10pmol)  1         1      1       1            1
Taq酶            0.4       0.4    0.4     0.4          0.4
ddH20            16.3      16.3    16.3    16.3        16.3
total            25ul      25ul    25ul    25ul       25ul
各试剂均加好后,离心机上甩一下,使之沉底,置于PCR仪上
反应程序:     94℃      4分钟
94℃      20秒
53.6℃   20秒      35个循环
72℃      4分钟
72℃      10分钟
4℃       24小时
待PCR反应进入4℃后,取下PCR薄壁管,取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳,同时上1Kb DNA ladder
半小时后照相,观察胶图:insert、vector、阴性三个样品除了有少量引物带(大约在200bp左右)外,均无其他带形。阳性带形清晰。好的连接产物应在500
至4、5Kb大小之内形成一条清晰的smear。

六.电转化流程
1.电转化感受态细胞的制备
1. 用枪头挑取单克隆菌落,投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。(同时做培养基和枪头的空白对照)
2. 37℃,220rpm,培养14-16个小时。
3. 第二天,以1:100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中,37度,220rpm,振摇2-3小时,每半小时测一次OD,当OD值达到0.3-0.4时,停止培养。
4. 将菌液在冰上预冷30分钟,随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中,4℃,2500rpm离心10分钟。
5. 弃上清,离心杯中加入少量ddH2O,使沉淀悬浮后,再将水注满离心杯,4℃,4000rpm离心10分钟。
6. 弃上清,加少量灭菌水,重悬菌体,再将水注满离心杯,4000rpm,4℃,离心10min。
7. 弃上清,往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌,预冷),重悬菌体,再加满10%甘油,  4℃, 4000rpm, 离心10min。
8. 弃上清,每个离心杯中加入5ml10%的甘油,使沉淀悬浮后,将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中,-80 ℃冰箱中保存。同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化,检测转化效率。
9. 次日观察转化子生长情况,并记录。
2.连接产物纯化
1.将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中,加入下列试剂:
10ul  of  ddH2O
2ul   of  3M NaAC(PH5.2)
50ul  of  无水乙醇
轻轻混匀,稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上;
2.4℃,top Speed 离心30分钟;
3.小心移去上清,避免接触到管底的沉淀物;
4.加入500ul70%的乙醇,轻轻颠倒几次洗涤沉淀(注:不要离心混匀);
5.4℃,top Speed离心5分钟;
6.小心移去上清,将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味;
7.加入10ulddH2O重新溶解沉淀,4℃短期保存,-20℃长期保存备用;
3.电转化
1. 从-80℃冰箱中取出感受态细胞,置于冰上解冻;
2. 取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中,将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。
3. 将40~100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中,小心混匀,冰上放置10min。
4. 打开电转仪,调至Manual,调节电压为2.1KV。
5. 将此混合物转移至已预冷的电极杯中,轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部;
6. 将电极杯推入电转化仪,按一下pulse键,听到蜂鸣声后,向电击杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基,重悬细胞后,转移到1.5ml的离心管中。
7.37℃,220-250rpm复苏1小时。
8. 取20ul转化产物加160ulSOC涂板,放于37℃温室,过夜培养,次日查看转化结果。其余菌液加1:1的30%的甘油后混匀-80℃保存。
注:每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80μl ,SOC 80μl,IPTG 20 μl。
4.电击杯清洗流程
1. 用清水将电击杯稍冲一下。
2. 向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。
3. 弃去酒精,再用蒸馏水冲洗2~3遍,然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。
4. 加入无水乙醇2ml于电击杯中,浸泡30分钟。
5. 弃去无水乙醇,于通风厨内挥干乙醇。
6. 将清洗好的电击杯放入-20 ℃冰箱内待用。
注:1.不同样品使用的电机杯应分开;
    2.每周用1%酒精浸泡30分钟。

七.快速鉴定、菌落PCR
1.质粒快速鉴定  
试剂:
Protoplasting buffer:
30mM Tris-HCl, pH8.0                   0.33ml/1.0M
      5mM EDTA                               0.1ml/0.5M
      50mM NaCl                              0.1ml/5.0M
      20% Sucrose                            5ml/40%
      50µg/ml RNAseI                         50ul/10mg/ml
      50µg/ml lysozyme                       50ul/10mg/ml
补水至10ml,-20℃分装保存。
 Lysis buffer:
89mM Tris-HCl, pH8.0
89mM boric acid               2ml of 5×TBE
2.5mM EDTA
2% SDS                        2ml of  10%
5% sucrose                    1.25ml of 40%
0.04% bromphenol blue         4mg
补水至10ml,-20℃分装保存。
步骤:
1.将转化后的菌液铺平板,37℃过夜培养。
2.配制0 .6--0 .7%的琼脂糖TBE 胶。
3.用连续加样枪在96孔板中每孔加入10 µl Photoplasting Buffer。
4.用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至含有Photoplasting Buffer 的96孔板中,振荡混匀。
5.用连续加样枪将Lysis Buffer上样于凝胶中,每孔4 µl,用排枪将细胞与Protoplasting buffer混合液上样于凝胶中(细胞在Protoplasting buffer中不宜超过30-40 min),并点上Marker。
6.调节电压为20V(小槽)或40V(大槽),电泳15min,使细胞充分裂解,将电压调高到200V,继续电泳1hr,照相。
7.根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。
2.菌落PCR
1.取适量PCR薄壁管,置于冰上,每管先加入17.3ul的灭菌水。
2.用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中,振荡混匀。
3.依次加入:
                 10xbuffer        2.5           
Mgcl2(25mM)        1.8
DNTP(2.5mM)        1        
T3 引物(10pmol)  1            
T7 引物(10pmol)  1        
Taq酶            0.4     
total           25ul    
各试剂均加好后,离心机上甩一下,使之沉底,置于PCR仪上
4.94℃,2min。
5.            94℃      4分钟
94℃      40秒
53.6℃    40秒      35个循环
72℃      4分钟
72℃      10分钟
4℃       24小时
6.待PCR反应进入4℃后,取下PCR薄壁管,取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳,同时上1Kb DNA ladder。半小时后照相,观察胶图,根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。
7.将快速鉴定和菌落PCR检测合格的文库送检。

八.pBlueScript cDNA库扩增
1.试剂及配方:
2 x LB (1升):
        20g    氯化钠
        20g    蛋白提取物
        10g    酵母提取物
      加入蒸馏水至1升,用NaOH调pH值至7.0,高压灭菌
2 x LB-甘油(12.5%)(200ml)
175ml  2 x LB液体
25ml   甘油(100%)
加入蒸馏水至200ml,压灭菌,置于4℃备用

2.步骤
1. 将cDNA文库转入大肠杆菌,如DH5a(DH10B)后,取少量菌液涂布氨苄平板,以推算克隆总量。
2. 取一大小合适的三角瓶,根据克隆总量配制2 x LB液体,每500ml 2 x LB液体可扩增5x105个克隆,可以适当增加2 x LB液体的量,但不能少于此比例
3. 按每100ml加0.3g的比例在2 x LB液体中加入SeaPrep agarose
4. 70℃加热搅拌至琼脂糖溶解,高压灭菌后再70℃搅拌30分钟.
5. 37℃放置1小时
6. 加入适量安苄青霉素,使之终浓度为50ug/ml
7. 加入全部菌液,并轻柔旋转使之混匀,避免振荡
8. 将三角瓶置于冰水中1小时,水面必须没过三角瓶内液面
9. 轻轻取出三角瓶,30℃培养40-45小时
10.将三角瓶内容物全部转入离心管中,离心10,000g ,20分钟,必须室温
11.弃上清,每100ml培养基离心得到的沉淀用10ml 2x LB-甘油(12.5%)重悬.
12.将重悬液留下10ul检测滴度,其余分装于1.5ml离心管,-80℃冰箱内保存
13.取1ul扩增后菌液倍比稀释.
14.各取10ul 稀释为10-5和10-6的菌液涂布于含安苄青霉素的LB固体平板上,37℃过夜培养,次日计算其克隆数以及扩增后总克隆数.

实验:质粒的提取和纯化编辑本段回目录

实验目的:了解碱裂解法制备质粒的原理,掌握质粒的小量制备方法。
实验原理:质粒DNA的抽提是基因工程操作中最常用与最基本的技术,现已有多种成熟的方案可供选择。最常用的有利用碱性条件下质粒DNA与染色体DNA变复性的不同进行分离的碱法;利用酸性、低离子强度时超螺旋在水相中,开环、线型分子在酚相中进行分离的酸酚法;利用羟基磷灰石在特定的条件下(8mol/L尿素,0.24mol/L磷酸缓冲液pH=6.8)只吸附双链DNA的羟基磷灰石法(在上述条件下染色体DNA均成单链,质粒DNA保持双链)等。本实验选做的是碱法。
1. 裂解细胞  裂解细胞是指通过溶菌酶、去污剂等试剂破裂细胞壁与膜的过程。对于不同的菌要选用不同的方法,通常有煮沸法、非离子型去污剂法、碱性SDS法(简称碱法)等。三种方法比较而言,非离子型去污剂法较温和,适用于抽提10kb左右的质粒;而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈,只能抽提小于10kb的质粒。常用的离子型去污剂是SDS、非离子型去污剂有Triton X-100等。
2.分离  即将质粒DNA和染色体DNA分离。碱法的分离原理如下:大肠杆菌的染色体约有4700kb长,在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链DNA片段。当溶液的pH调到大于12时双链DNA中的氢键被破坏,于是染色体DNA的双链分离成单链;而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢键被破坏,并只发生部分双链解离成单链的变化。再当pH调回中性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子,而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子,通过离心的方法很容易将二者分开,达到分离的目的。
3.纯化  细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外还有各种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类物质及RNA。纯化的步骤就是有针对性地将它们去除。RNA可用牛胰Rnase A分解除去。蛋白质可通过酚、酚/氯仿、氯仿/异戊醇,使蛋白质变性剂而除去,同时,氯仿有强烈的溶脂倾向,对于在除去蛋白质的同时去除脂质类杂质很有好处。氯仿还能将微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉,而微量的酚对于以后的酶切、转化等过程都会产生不利影响。氯仿/异戊醇的蛋白质变性能力较弱,主要用于含酚试剂处理后的抽提。
正确的去除蛋白质杂质的过程应该是酚一酚+氯仿((1:1))一氯仿(或氯仿/异戊醇24:1),处理,根据实验情况也可考虑省略第一或第二步,但切记不可将氯仿(氯仿/异戊醇)的处理步骤省略掉。抽提过程完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等,可用乙醇沉淀的方法将它们除去。用无水乙醇沉淀的特点是能将DNA进行浓缩,且同时也更换了整个缓冲系统,但DNA也有一定的损失。

实验内容:
试剂
1.LB培养液(1L)
细菌培养用蛋白胨    10g
细菌培养用酵母粉    5g
NaCl  10g
用10mol/L NaOH调至pH7.0,高压蒸气灭菌, 4℃贮存.

2.溶液Ⅰ,可成批配置,灭菌后4℃贮存。
葡萄糖 50mmol/L
Tris-C1(pH8.0) 25mmol/L
EDTA 10mmol/L
3.溶液Ⅱ(新鲜配制)
NaOH   0.2mol/L
SDS     1%
4.溶液Ⅲ
5mol/L KAc 60ml
冰醋酸 11.5ml
水 28.5ml
配制好的溶液Ⅲ含3mol/L钾盐,5mol/L 醋酸(pH4.8)
卡那霉素(Kana): 50mg/ml, 过滤除菌.
5.重蒸酚  市售苯酚蒸馏纯化(收集179~181℃之间的酚)后,用TE饱和,使水相的pH在7.5以上,4℃保存。
6.氯仿  异戊醇(24:1)
7.无水乙醇
8.RNaseA(10mg/ml)
9.3mol/L  NaAc(pH5.2)
10.TE    10mmol/L  Tris-C1(pH8.0)    1mmoI/L  EDTA

材料
    含有质粒(pNTE-EGFP, pEGFPN3)的大肠杆菌DH5a.
操作步骤
    1.挑取琼脂培养板上的含有pNTE-EGFP, pEGFPN3质粒的单菌落,接种至5ml LB培养液(含Kana 50μg/m1),37℃振荡培养过夜。
    2.取出1.5ml培养液至1.5ml离心管中,12 000r/min离心2min,弃上清。
    3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液工中,强烈振荡混匀。
    4.加入200μl溶液Ⅱ,盖严管盖,轻轻颠倒混匀5次,冰浴5min。
    5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ,温和振荡10s,冰浴5min。
    6.12 000r/min 室温离心5min,取上清至一个新的无菌的1.5m1 Eppendorf管中。
  7.加入等体积酚/氯仿(1:1),振荡混匀,12 000r/min离心2min,上清转移至另一个Eppendorf管中。【注意】酚具有腐蚀性,操作时小心。
   8.加人等体积氯仿,振荡混匀,12 000r/min离心2min,上清转移至另一个Eppendorf管中。
  10.加入2倍体积预冷无水乙醇-20℃沉淀10min。
  11.12 000r/min离心10min,去上清,沉淀用70%乙醇洗涤一次,空气中晾干。
  12.加入20μl TE溶解质粒DNA,加入RNaseA,终浓度20μg/m1 37℃水浴0.5h。
13 经0.7%琼脂糖凝胶电泳,EB染色后观察抽提结果。【注意】EB为致癌物,操作时一定要戴乳胶或一次性手套。
  14.将该管质粒保存于-20℃备用。
注意事项
  1.该实验成功的标志是把染色体DNA、蛋白质与RNA去除干净,获得一定得率的质粒DNA。去掉染色体DNA最为重要,也较困难,因为在全部提取过程中,只有一次机会去除染色体DNA,其关键步骤是加入溶液Ⅱ与溶液Ⅲ时,控制变性与复性操作时机,既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性,又要使染色体DNA不断裂解成小片段,从而能与质粒DNA相分离。这就要求试剂与溶菌液充分摇匀,摇动时用力适当,一般来说当溶液Ⅰ加入时可用力振荡几次,因为此时细菌还没有与碱和SDS作用,染色体DNA尚未释放,不必担心其分子断裂,加入SDS后,则要注意不能过分用力振荡,温和混匀,但又必须让它反应充分。加入溶液II混匀之后,一定在冰上放置,不要摇动,对于溶液溶液III,同样处理!
  2. 加入溶液I之前,注意将离心管倒扣过来,将培养基完全流出.
  2.加乙醇沉淀DNA时,要把离心管加盖倒翻摇动4~5次,注意观察水相与乙醇之间没有分层现象之后,才可以放在冰箱中去沉淀DNA,以获得更多的DNA。
  3.乙醇沉淀DNA离心后,要把离心管四周的上清液抽干或自然挥发(可将离心管倒置于滤纸上以尽量让管内液体流出)。否则,用TE缓冲液溶解DNA时,既困难又不完全。
  4.为了得到纯净的DNA样品和清晰的电泳条带,加入1μl RNA酶,将管置50℃水浴箱内30min,消化RNA。
  6.抽提产物经电泳分离、EB染色后,在紫外线灯下可观察到三个条带,自前往后分别为:超螺旋、线性及开环质粒DNA。

实验:质粒DNA的电泳和纯度检测编辑本段回目录

实验目的:掌握DNA琼脂糖电泳技术,了解紫外分光光度法测定DNA浓度和纯度的原理。
实验原理:带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。其中,凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点,使它成为分离、鉴定和提纯核酸的首选标准方法。
    与蛋白质分子类似,核酸分子也是两性解离分子。在pH3.5时,碱基上的氨基基团解离,而三个磷酸基团中只有第一个磷酸解离,整个分子带正电荷,在电场中向负极泳动;在pH值为8.0~8.3时,碱基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电荷,向正极移动。不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同,在自由泳动时,各核酸分子的迁移率区别很小,难以分开。所以采用适应浓度的凝胶介质作为电泳支持物,发挥分子筛的功能,使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异,达到分离的目的。值得注意的是,等长度的单链DNA和双链DNA在中性或碱性凝胶中的迁移率大致相等。
    1.影响泳动的四大因素
    (1)影响泳动的首要因素是电泳样品的物理性质:包括电荷多少、分子大小、颗粒形状和空间结构。一般来说颗粒带电荷的密度愈大,泳动速率愈快;颗粒物理形状愈大,与支持物介质摩擦力越大,泳动速度越小。即泳动率与颗粒的分子大小,介质粘度成反比;与颗粒所带电荷成正比。在检测未知DNA分子量时,DNA分子的空间构型不同,即使相同的分子量其迁移率也不同。如质粒DNA存在闭环(Ⅰ型,CC),单链开环(Ⅱ型,OC)和线性(Ⅲ型,L)。三者之间的迁移速率,一般为Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型,但是有时也会出现相反的情况,因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及溴乙锭染料含量有关。当胶浓度较高或电场强度较大时,Ⅰ型DNA与Ⅲ型DNA互换位置,而Ⅱ型DNA总是迁移最慢。
    (2)支持物介质:DNA的凝胶电泳常使用两种支持材料:琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。通过这两种介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小,分离不同分子量的核酸片段。琼脂糖凝胶的孔径大,可以分离长度为100bp至近60kb的DNA分子;聚丙烯酰胺凝胶的孔径小,可分离小片段(5~500bp)DNA,效果最好。因此,选用不同的凝胶种类和浓度可以分辨大小不同的DNA片段。
(3)电场强度:电泳场两极间单位支持物长度的电压降即为电场强度或电压梯度。电场强度愈大,带电颗粒的泳动速率愈快,但凝胶的有效分离范围随电压的增大而减小。在低电压时,线性DNA分子的泳动率与电压成正比。一般凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm;对于大分子量真核基因组DNA片段的电泳常采用0.5~1.0V/cm电泳过夜,以取得较好的分辨率和整齐的带型。电压1000~2000V,电场强度20~600V/cm的电泳为高压电泳,必须用聚丙烯酰胺做介质。
(4)缓冲液离子强度:缓冲液是电泳场中的导体,它的种类、pH值、离子浓度直接影响电泳的效率。Tris.C1缓冲体系中,由于Cl—的泳动速度比样品分子快得多,易引起带型不均一现象,所以常利用TAE、TBE和TPE三种缓冲体系。缓冲液的pH值直接影响DNA解离程度和电荷密度,缓冲液pH值与DNA样品的等电点相距越远,样品所携带电荷量越多,泳动速度越快。DNA电泳缓冲液,常采用偏碱性或中性条件,使核酸分子带负电荷,向正极泳动。缓冲液的离子强度与样品泳动速度成反比,电泳的最适离子强度一般在0.02~0.2之间。
2.指示剂
 电泳过程中,常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程。核酸电泳常用的指示剂有是溴酚蓝,溴酚蓝呈蓝紫色,分子量为670Da,在不同浓度凝胶中,迁移速度基本相同,它的分子筛效应小,近似于自由电泳,故被普遍用作指示剂。在0.6%,1%,2%的琼脂糖凝胶中,溴酚蓝的迁移率分别与1kb,0.6kb和0.15kb的双链线性DNA片段大致相同。指示剂一般加在电泳上样缓冲液中,为了使样品能沉人胶孔,还要加入适量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重。
3.染色剂 
核酸需经过染色才能显示出带型,最常用的是溴乙锭染色法。溴乙锭(ethidium bromide,EB)是一种荧光染料,这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对碱基之间,在紫外线激发下,发出红色荧光。EB-DNA复合物中的EB发出的荧光,比游离的凝胶中的EB本身发出的荧光强大10倍,因此不需要洗净背景就能清楚地观察到核酸的电泳带型。通常,可以在凝胶中加入终浓度为0.5μg/m1的EB,这样在电泳过程中可以随时观察核酸的迁移情况,这种方法适用于一般性的核酸监测。也可以在电泳结束后用0.5μg/m1的EB溶液染色10-15min后进行紫外观察,由于EB在可见光下易分解,故应存棕色瓶中于4℃条件下保存。[注意]:EB有潜在的致癌危险,操作时必须戴乳胶手套或一次性手套。
实验内容:
试剂
(1)质粒pNTE-EGFP。
(2)琼脂糖。
(3)10mg/ml溴乙锭溶液。
(4)DNA分子量参照物(marker)。
(5)50×TAE电泳缓冲液。
(6)10×溴酚蓝上样缓冲液。

2.器材
(1)恒温水浴
(2)电泳槽
(3)电泳仪
(4) 微波炉
(5)紫外线检测仪
(6)移液器;100-1000μl, 10-100μl,0.5-10μl
操作步骤
电泳
(1) 称取1.0 g琼脂糖,加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中。
(2) 加热或沸水浴后使琼脂糖溶解。
(3) 凝胶冷至60℃左右,加入溴乙锭至终浓度为0.5μg/m1。
(4) 将琼脂糖溶液倒人模具,凝胶厚度一般为0.3~0.5cm,检查有无气泡。室温下15~30min后,琼脂糖溶液完全凝固。
(5) 连接电泳槽与电泳仪之间的电源线,正极为红色,负极为黑色。
(6) 取掉模具两端的胶布,放入电泳槽,加样孔在负极端。
(7) 加入1×TAE电泳缓冲液至电泳槽中,液面高于胶面1mm,小心取出梳子。
(8) 取5μl实验一制备的质粒DNA,在DNA样品中加入1/10的上样缓冲液并混匀。
(9) 用移液器将DNA样品加入梳孔中。
(10)接通电源,DNA样品往正极移动。电压选择为3~5V/cm。注意:长度以两个电极之间的距离计算。
(11)根据指示剂迁移的位置,判断是否终止电泳;切断电源后,含EB的凝胶可以直接于紫外线灯下观察结果或拍照记录。

浓度和纯度分析:
1 取10μl DNA 用TE缓冲液稀释至1ml,混匀。以无DNA的TE为空白,测定样品在260nm和280nm波长下的光密度吸收值,每个样品重复3次,取3次结果的平均值作为最终结果。
2 换算出OD260/OD280的比值,较纯的DNA,该值在1.6-1.8之间。
3 根据双链DNA 1 OD260nm=50g,计算出样品DNA的浓度,计算公式为所测的OD260nm ×50/10(g/l)

附录一、核酸换算数据

   
dsDNA 10kb=6.60106 Dalton 1 OD260nm=50g
ssDNA 10kb=3.30106 Dalton 1 OD260nm=40g
RNA 10kb=3.45106 Dalton 1 OD260nm=40g

附录二、琼脂糖凝胶浓度与线性DNA的最适分辨范围

 

   


 

实验:重组DNA转化大肠杆菌编辑本段回目录

实验目的  掌握CaCl2制备感受态大肠杆菌的方法和化学转化法。
实验原理  通过冰冷的CaCl2溶液处理大肠杆菌,细菌处于0℃、CaCl2低渗液中,菌细胞膨胀成球形,使之处于短暂的“感受态”,在这期间,细菌能够摄取各种不同的外源DNA片段或基因,使受体细胞获得供体基因的某些性状,质粒DNA的转化是重组DNA技术中重要的一环。
常用的转化方法
1.化学法转化  包括了CaCl2、氯化钙/氯化铷、MgCl2等方法,所有化学法转化均需制备感受态细胞。
    通过化学方法,可人工诱导细菌细胞进入感受态,最经典的是CaCl2法(1972年),其原理是细菌处于0℃、CaCl2低渗液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA与钙离子结合形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促进细胞吸收DNA复合物;通过在丰富培养基中恢复1h左右,球状细胞复原,转化子中的抗性基因得以表达;随后将菌液涂布于含抗生素的选择性培养基平板上,转化子可分裂、增殖,形成菌落。
转化效率是衡量菌体处于感受态的细胞多少的指标,一般定义为1μg环状质粒DNA在感受态细胞过量的情况下产生转化子的个数。Ca2+处理的感受态细胞,转化效率可达105~106个转化子/μg环化DNA。
影响转化率的关键因素:①生长时期:实验发现在对数中期的大肠杆菌易生成感受态。转化时菌浓度应控制在不超过107/ml。②CaCl2法0℃放置时间的影响:细菌经0℃ CaCl2处理后转化率随时间的推移而增加,24h达到最高,之后转化率逐渐下降。③化合物及无机离子的影响:在Ca2+的基础上,联合其他二价金属离子(如Mn2+,CO2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,可使转化率提高100~1000倍。④质粒大小、构型的影响:通过构建相同复制起点的不同大小质粒进行转化时发现,从2kb到3.2kb的转化效率上升,此后到66kb转化效率线性下降。同时,开环状质粒只有超螺旋质粒转化率的75%,线型质粒的转化率更要低100~1000倍,线型转化率低是因菌体中核酸外切酶将进入的线型DNA降解的原因。⑤菌株基因型recA+与recA—的影响:recA基因是rec系列中最主要的基因,编码同源重组蛋白。考虑到质粒DNA在recA+菌中存在与细菌染色体DNA整合的可能,因而,通常在转化实验中都选用recA—菌株作为宿主菌。
   实验内容
试剂与材料
    1.菌株  DH5等。
    2.重组质粒  pNTE-GFP。
    3.100mmol/L CaCl2,用纯水配制。
    4.氨苄青霉素(100mg/m1),用无菌水配制并过滤(0.22μm)除菌,滤液于-20℃冰箱中保存。
    5.LB平板  LB培养液中加入1.5%琼脂粉,高压消毒(15磅20min),稍冷却后铺平板。
    6.含抗生素LB平板  配方同上,高压消毒后,冷却至65℃左右,加入氨苄青霉素,终浓度为50~100μg/m1培养液,加入抗生素后立即倒平板。
    7.培养皿及1.5ml离心管等。
操作步骤
1. 将DH5细菌接种在LB平板上,37℃培养过夜。
2.从LB平板上挑取DH5单个菌落接种在5ml LB培养基中,37℃振荡培养过夜。
   3. 次日取0.5-1.0ml上述菌液,接种于50 ml新鲜LB培养液中,37℃振荡培养OD600=0.4-0.5;4℃10min,然后4℃ 4000r/min离心8min,弃去上清液。
   4. 沉淀的菌体悬浮于20m1 0.1mol/L冷CaCl2内,冰浴中放置30min,4℃4000r/min离心8 min。
   5.沉淀的菌体再悬浮于2m1 0.1mol/L冷CaCl2溶液,并置于冰浴中。
      (感受态细菌可以在12.5%的无菌甘油-70℃保存)
6.取3支1.5ml离心管,按下表加试剂和操作:
试  剂 管1 管2 管3
连接产物 10μl  
质粒(100ng/μ1)  1μl 
H2O  9μl 10μl
感受态细胞 200μl 200μl 200μl
     7.冰浴中放置30min。
     8.42℃热冲击90s后,立即放入冰浴,放置2-5分钟。
     9.每管加入新鲜LB培养液0.85m1。
     10.37℃剧烈振摇培养60min。(转速不低于225RPM)
     11.5000r/min离心1min, 弃去上清液保留培养基100~200μl,充分悬浮细菌,分别涂布于含氨苄青霉素的LB平板,加入的菌液用玻棒均匀推开。以上操作均需在无菌条件下进行。平板在37℃温箱内培养过夜。次日观察各平板上菌落生长情况,并算出转化率即每微克DNA能转化多少个细菌。
注意事项
    1.致敏缓冲液中试剂的纯度与浓度对转化率影响很大,试剂必须为分析纯,同时,致敏缓冲液最好避光贮存于40C。
    2.制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴低温操作,同时注意无菌操作,防止感受态细胞受杂菌污染。
3.42℃热处理时间很关键,转移速度要快,且温度要准确,同时注意热处理过程中离心管不要摇动。
4.菌液涂皿操作时,应避免反复来回涂布,因为感受态细菌的细胞壁有了变化,过多的机械挤压涂布会使细胞破裂,影响转化率。
5.实验用的玻璃器皿、微量吸管及Eppendorf管等,应彻底洗净并进行高压消毒,表面去污剂及其他化学试剂的污染往往大幅度地降低转化率。

实验:PCR法快速鉴定重组载体编辑本段回目录

    掌握PCR法快速鉴定重组载体的基本操作。
实验原理
    PCR(polymerase chain reaction)是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。在分子生物学研究中,广泛地应用于研究基因突变,获取加上酶切位点的目的基因和DNA序列测定等方面,也可以用来鉴定重组载体,是分子生物学中一项极为常用的技术。
    PCR的原理是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。两个引物分别位于靶序列的两端,同两条模板的3'端互补,由此限定扩增片段。PCR反应由一系列的变性——退火——延伸反复循环构成,即在高温下模板双链DNA变性解链,然后在较低的温度下同过量的引物退火,再在适中的温度下由DNA聚合酶催化进行延伸。由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板,因此扩增产物的量以指数级方式增加。理论上,经过n次循环可使特定片段扩增到2n-1,考虑到扩增效率不可能达到100%,实际上要少些,通常经25~30次循环可扩增106倍,这个量足够分子生物学研究的一般要求。PCR法快速鉴定重组载体的基本原理是直接取沸水浴裂解的重组质粒DNA为摸板,通过特异引物的特异扩增来鉴定外源片段是否重组。
实验内容
仪器和试剂
1.仪器  PCR仪,微型水平电泳槽,电泳仪,水浴锅,离心机等。
2.试剂
(1)50×TAE电泳缓冲液 
(2)10×PCR缓冲液: 
(3)4种dNTP混和液 10mmol/L
(4)Pfu DNA聚合酶 (5U/μl)
(5)引物(20μM) 
(6)10×溴酚蓝上样缓冲液 
方法和步骤
1 取培养过夜的转化菌液20μl,沸水浴3-5分钟。
2 12000rpm 离心2分钟。取上清液作为PCR的摸板
3在 PCR仪上设置好程序。
4在1个灭菌的0.5ml离心管中,按下列顺序加样,建立20μl反应体系。
ddH20 12μl
10×PCR Buffer(无Mg离子) 2μl
25mM Mg离子 1.5
dNTP(10mM each) 0.5μl
Primer l(20μM) 0.5μl
Primer 2(20μM) 0.5μl
模板DNA
TaqDNA聚合酶(2.5U)               2μl
1μl
总体积                     20μl
5混匀,短暂离心.   
6放在PCR仪上进行PCR反应。94℃变性3min,94℃45秒,64℃ 1分钟,72℃3分钟,20个循环。(用旧式的PCR仪进行基因扩增时还要求覆盖约50μl (一滴)液体石蜡油,改进后的PCR仪已经不用液体石蜡油覆盖。)
7 取10μl PCR反应液及1μl上样缓冲液混合,进行1% 琼脂糖电泳(5V/cm),选择适当大小的DNA分子量标准(DL2000),检查扩增产物。紫外观察,必要时拍照。如果得到与插入片段大小一致的片段,说明已经成功重组。
注意事项
1.PCR是建立在一定量的模板和与之专一性互补配对的一对引物之上的,因此,在进行PCR前,菌液的充分裂解变性和引物设计尤为重要。
2.Mg2+对Taq DNA聚合酶的活性影响很大,有时按照试剂商提供的说明扩增不出目的基因时,不妨适当增加Mg2+的浓。

实验:限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒编辑本段回目录

实验目的
  掌握单、双酶切的技术,理解酶切法进行重组质粒进行鉴定的原理。
实验原理
(一)酶切
    各种限制性内切酶能专一地识别碱基顺序,例如,EcoRⅠ酶的识别顺序为:GAATTC;Scal  I酶的识别顺序为:AGTACT,用EcoR I和Scal I同时酶解含有这两个单一酶切位点的环状双链DNA分子,就产生两条带有相应酶切位点的线性DNA分子。
    当EcoR I和Scal I同时酶切一个质粒DNA时,酶切反应必须完全。不同酶切反应都需要Mg2+并要求一定的盐离子浓度,但不同的酶达到最佳酶切效率所需的盐浓度不同。因此生产厂商在销售酶的同时往往附带专门的缓冲液。如果盐离子浓度使用不当,会使酶的识别位点发生改变,例如当盐离子浓度低于50mmol/L时,EcoR I内切酶的专一性就降低,只能识别中间的4个核苷酸序列(称该酶为EcoR I*)。绝大多数酶的反应温度是在370C,酶切反应时间需30min、60min以至2h以上。一般来说,如酶的纯度不佳,酶切时间不能太长。终止酶切反应时,大多数可在65℃水浴中,保温10min,就可使大部分酶失活。EcoR I酶置65℃水浴中,保温10min,丧失95%的酶活性。内切酶一般都保存在50%甘油的缓冲液中。当保存在10%甘油中时,酶活力丧失更快。少数较耐热的酶,在加热前先加pH7.5的EDTA,至终浓度为10mmol/L。EDTA螯合了反应系统中所有的二价阳离子,就更便于终止酶切反应。
    酶切要完全,酶解的数量也要适当。设计酶解DNA的数量时,除了根据连接与转化的要求外,还要按照DNA浓度的高低,酶液单位的高低等具体情况而定。同时还要考虑到DNA每经一步处理,就得重新纯化,这样DNA浓度的损失量几乎达到50%。并且每经一步操作后,都要取一定量的DNA样品进行电泳鉴定或作为电泳对照样品。因此,在设计酶解数量时,不能用量太少,但是酶解数量过多,势必要消耗大量限制性内切酶和DNA,这也是不必要的。
    至于酶的用量,一般的做法是控制在1U酶在15—20μl中酶解1μgDNA,但具体地分析应该对不同的DNA,酶的用量有所不同,如EcoR I酶对4.3kb的pBR322有一个切点,而对14.5kb的pXZ 6有两个切点,如果不考虑其他构型的影响,则每微克pBR322的酶用量与每微克pXZ6的用量之比应该为1.69:1(酶单位)。
酶解的体积,一般酶切0.2~1.0μg的DNA时,控制反应体积为15~20μl。根据酶解DNA的数量,按比例适当放大体积。如果酶切反应总体积太大,使DNA浓度与限制酶浓度稀释,分子之间难以接触,酶切效果就差,因而尽可能做到反应体积为最小。但是,酶切反应混合物中甘油的含量不能超过5%,否则将会抑制酶的活性(通常将酶量控制在反应总体积的1/10以下)。当使用的限制酶活性不高时,必须加大限制酶的用量。这时为了酶的用量体积不超过反应总体积的10%,其酶切反应体积不可能保持到最小。另外,由于我们提取到的DNA,大多都是保存在TE缓冲液中。如果DNA浓度很稀,加入反应系统中的体积要增大,这时TE中的EDTA将会与酶的激活因子螯合,影响酶切效果。为此,也不得不放大反应体积或者将DNA重新浓缩。
双酶切时需要注意以下几点:(1)如果所用两种酶的反应条件完全相同(温度、盐离子浓度等)那么,可以将它们同时加到一个试管中进行酶切。(2)如果所用的两种酶对温度要求不同,那么要求低温的酶先消化,要求高温度的酶后消化,即在第一个反应结束后,加入第二个酶,升高温度后继续进行酶切。(3)如果两种酶对盐离子浓度要求不同,则要求低盐的酶先消化,要求高盐的酶后消化,具体方法是:在低盐缓冲液中加入第一个酶,反应结束后,补加1/10体积的高盐缓冲液,加入第二个酶再消化,或第一个反应结束后抽提DNA,再用高盐缓冲液酶切。目前,各试剂商都提供了双酶切缓冲液或通用缓冲液,可以根据说明书进行操作。
    (二)酶切鉴定重组质粒
当空质粒载体的多克隆位点插入外源DNA片断后,可以利用插入两端的限制性内切酶进行酶切对外源片断的重组进行鉴定。如果插入外源片断,两种酶的单酶切将会产生比空质粒大的片段,在电泳上表现为滞后片断。进行双酶切后将得到2条片断,一条和空质粒大小一致的片断令一条与插入片断一样大。

实验内容
试剂与器材
试剂
(1)10×酶切缓冲液(购酶时随附)
(2)EcoRⅠ酶;BamH I酶。
(3)无菌水。
(4)质粒pNTE-EGFP。
(5)琼脂糖。
(6)10mg/ml溴乙锭溶液。
(7)DNA分子量参照物(marker)。
(8)50×TAE电泳缓冲液。
(9)10×溴酚蓝上样缓冲液。
器材
(1)恒温水浴
(2)电泳槽
(3)电泳仪
(4)电炉
(5)紫外线检测仪
(6)移液器; 10-100μl,0.5-10μl
实验步骤
  酶切
  (1)设计单酶切反应和双酶切反应。
  (2)分别加入无菌水于0.5m1离心管中。
  (3)分别加人10×酶切缓冲液(反应总体积的1/10)。
(4)分别加入pNTE-EGFP质粒DNA。
  (5)分别加入EcoR I;BamH I酶和EcoR I+ BamH I酶。酶量的加入通常是其活力的5-10倍.同时做一个pEGFPN3质粒DNA的EcoR I单酶切。
  例如: ddH2O                 12μl    
        10×酶切缓冲液         2μl
        DNA(1μg)             5μl
        EcoR I(或)BamH I    1μl
                            20μl
 ddH2O                 11μl    
       10×酶切缓冲液        2μl
       DNA(1μg)             5μl
       EcoR I                1μl
BamH I               1μl
                            20μl
 (6)混匀,离心5s。
  (7) 37℃,1h。
  (8)加入3μl 10×溴酚蓝上样缓冲液混匀后进行1%的琼脂糖凝胶电泳,成像观察。

  电泳
(9)称取1.0 g琼脂糖,加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中。
(10) 加热或沸水浴后使琼脂糖溶解。
(11) 凝胶冷至60℃左右,加入溴乙锭至终浓度为0.5μg/m1。
(12) 将琼脂糖溶液倒人模具,凝胶厚度一般为0.3~0.5cm,检查有无气泡。室温下15~30min后,琼脂糖溶液完全凝固。
(13) 连接电泳槽与电泳仪之间的电源线,正极为红色,负极为黑色。
(14) 取掉模具两端的胶布,放入电泳槽,加样孔在负极端。
(15) 加入1×TAE电泳缓冲液至电泳槽中,液面高于胶面1mm,小心取出梳子。
(16) 在DNA样品中加入1/10的上样缓冲液并混匀。
(17) 用移液器将DNA样品加入梳孔中。电泳样品为:酶切样品;酶切前的对照样品;分子量参照物
(18)接通电源,DNA样品往正极移动。电压选择为3~5V/cm。注意:长度以两个电极之间的距离计算。
(19)根据指示剂迁移的位置,判断是否终止电泳;切断电源后,含EB的凝胶可以直接于紫外线灯下观察结果或拍照记录。
注意事项
1. 酶切反应的影响因素很多,操作时首先要保证质粒DNA的纯净,样品中过高的盐分和痕迹量的酚等都会使酶切反应无法正常进行。
2. 酶切反应在冰上进行.严格控制内切酶的用量在总反应体积的1/10,否则,甘油浓度过高会抑制酶活性。不同的酶使用不同的反应液,注意相符合.双酶切时选择两种酶活性均较高的反应液,不能选择合适的反应液时,先使用低盐反应液,加入相应的酶,然后补加一定的盐离子和对应的酶.
3. 尽可能地降低反应总体积,增大酶与底物间的碰撞机会,增加反应速度。
4. 倒胶时不能有气泡留在胶层中,电泳时注意去除模具两端的胶布和正负极的对接。

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