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基因芯片技术及其在农业上的应用

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1 基本概念

生物芯片(b ioch ip ) 是指通过微加工技术和微电子技术在固格体芯片表面构建的微型生物化学分析系统, 其分析实质是指在基片表面点阵排列了一系列可寻址的识别分子, 反应在相同的条件下进行, 反应结果用同位素法、化学发光法或酶标法显示, 然后用精密的扫描仪或CCD 摄像技术记录, 通过计算机软件分析, 形成可读信息, 实现对细胞、蛋白质、DNA 以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测. 利用生物芯片技术可以将生命科学研究中不连续的分析过程如样品制备、化学反应和定性定量检测等微型化、连续化, 尽量减少空间, 加快速度, 实现生物分析系统的芯片化. 这些分析过程中的某一步或几步微型化集成到一块芯片上就能获得具有特殊功能的芯片, 如用于样品制备的针对DNA 分析的介电电泳芯片[ 1 ]; 用于基因突变检测、基因表达和测序的DNA 微阵列芯片[ 2 ]和肽核酸(pep t ide nucleic acids, PNA ) 芯片[ 3, 4 ]; 用于蛋白质分析的蛋白质芯片[ 5 ]; 研究蛋白质与DNA 互作的双链DNA 芯片[ 6 ]等. 把上述分析过程全部或部分集成到一张芯片上就是芯片实验室(lab on ch ip )。 用这些生物芯片制作的生化分析仪器具有很多优点: 分析过程自动化, 生产成本低, 防止污染(芯片一次性使用) , 分析速度可以提高成千上万倍, 所需样品和药品的量可以减少99% - 99. 9% , 多样品处理能力极高, 仪器体积小、重量轻, 便于携带。

基因芯片(genech ip ) 是生物芯片的一种, 又称DNA 芯片(DNA ch ip )、DNA 微阵列芯片(DNA m i2 croarray ch ip ) 或寡核苷酸微芯片(o ligonucleo t ide m icroch ip )。 其利用杂交测序(sequencing by hyb ridiza2tion, SBH) 原理, 在载体表面建立可寻址的高密度DNA 分子微阵列, 通过与标记过的样品核酸序列互补匹配, 进行测序或生物基因信息的大规模平行检测。

2 研究背景

生物芯片的概念来自计算机芯片, 是20 世纪80 年代初提出来的, 最初主要指分子电子器件。 目前意义上的生物芯片是90 年代初提出来的, 该概念的提出与人类基因组计划(hum an genom e p ro ject, HGP)有关。 HGP 于1986 年3 月7 日由Du lbecco [ 7 ]首先提出, 1990 年10 月在美国正式启动。 其总目标是在15 a内投入30 亿美元, 测定人类基因组3×109 bp 全序列, 鉴定约10 万个人类基因. 人类基因组十分庞大, 需要快捷、准确、灵敏的测序方法。 然而传统的测序方法如Sanger 双脱氧链终止法和M axam 2Gilbert 化学修饰法技术复杂、耗时长、检测效率低下。 随着HGP 的逐步实施, 大量的新基因被发现, 使得测序方法改进的要求更加突出; 同时, 越来越多的开放读码框架(open reading f ram e, ORF) 被发现, 破译基因功能成为后基因组计划时期更加迫切需要解决的课题, 这些问题为DNA 芯片的诞生提供了客观需要。基因芯片是以核酸测序为目的出现的, 刚开始被称为生物芯片, 现在生物芯片的研究已经拓展到非核酸领域, 基因芯片的概念因此与生物芯片的概念区别开来。

基因芯片技术是由美国旧金山南部的San ta Clara 的一个新兴生物公司A ffym et rix 首先发展起来的. Steven Fodo r (现为A ffym et rix 公司总裁) [ 8 ]及其同事于20 世纪90 年代初发明了一种利用光刻技术在固相支持物表面上光导合成多肽的方法, 并在此基础上于1993 年设计出了一种寡核苷酸生物芯片[ 9 ] ,直至1996 年制造出世界上第一块商业化的DNA 芯片[ 10 ]. 在此期间国际上掀起了一股DNA 芯片设计浪潮, 出现了多种类型的DNA 芯片技术。1994 年在美国能源部防御研究计划署、俄罗斯科学院和俄罗斯人类基因组[ 11 ]计划1 000 多万美元的资助下研制出了一种基因芯片, 用于检测B2地中海人血样的基因突变,筛选了100 多个B2地中海贫血已知的突变基因. 这种基因芯片的基因解码速度比传统的Sanger 双脱氧链终止法和M axam 2Gilbert 化学修饰法快1 000 倍。初期试验的成功吸引了大量的商业资本。1995 年6 月29 日Mo to ro la 公司和Packard 公司与A rgonne 实验室合作开发具有商业价值的生物芯片及相关技术。

1998 年6 月29 日美国宣布正式启动生物芯片计划, 目前美国已经有八家生物芯片公司的股票上市。 迄今为止, 全世界有近两百家公司从事生物芯片相关工艺、设备及检测手段的研究和软件的开发. 目前全球生物芯片产业产值为10 亿美元, 形成了相当规模的新兴产业。 据基因公司估计, 到2005 年基因芯片产值可达到50 亿美元, 到2010 年可达400 亿美元。

我国在这一领域刚刚起步。 我国最先从事生物芯片研究的是中国东南大学微电子物理研究所, 该所拥有9 项国家专利和1 项国际专利。 国际专利技术——分子印章压印准固相原位合成技术使得以该研究所为依托的南京益来有限公司成为全世界拥有高密度基因芯片制造技术的两家公司之一(另一家为美国A ffym et rix 公司)。 1999 年5 月, 生物领域专家在南京和上海召开“生物芯片技术”研讨会, 将生物芯片技术作为重点课题予以启动。 1999 年6 月, 中国科学院上海细胞生物学研究所开发出我国第一块生物芯片——cDNA 芯片. 2000 年2 月, 深圳益生堂生物有限公司与军事医学科学院签署了一项协议, 共同开发生物芯片技术, 这一举措标志着我国生物芯片高新技术产业化正式起步. 目前, 清华大学生命科学工程研究院、军事科学研究院放射医学研究所、中科院上海冶金所、上海细胞生物所、湖南医科大学和华中农业大学等科研院所正在开展生物芯片技术及应用的开发研究。

3 基因芯片的类型和制作原理

基因芯片的种类较多, 根据目前的文献资料, 按照制备方法基本上可以分为两类: 一类是原位合成法,另一类是合成后交联法。

3. 1 原位合成法

原位合成法是目前制造高密度寡核苷酸芯片最成功的方法, 适用于寡核苷酸探针的合成, 主要有光刻法、压电打印法(也称喷印法) 和分子印章法. 光刻法可以合成30 nts 左右, 压电打印法可以合成40- 50nts; 光刻法每步缩合率较低, 一般为95% 左右, 合成30 nts 的产率仅为20%; 压电打印法可达99% 以上,合成30 nts 的产率可达74% , 在这个意义上讲压电打印法制备的基因芯片的特异性要比光刻法的高。 另外, 压电打印法不需要特殊的合成试剂. 分子印章法与压电法相似。

3. 1. 1 原位光刻合成技术 

A ffym et rix 公司的总裁Steven Fodo r 及其同事将半导体工业中的光学光刻制版技术[ 8, 12 ]和DNA 光导化学合成技术结合起来, 开发出光引导原位合成法. 光学光刻制版技术用来制备光刻掩模(pho to lithograph ic m ask) , 光导化学合成技术用来在固相载体上利用光进行DNA 合成。 运用这种方法制作的芯片密度可达106 个探针·cm - 2, 即探针间隔为5- 10 Lm 。 用这种方法制备的基因芯片需要预先设计、制造一系列掩模, 造价昂贵; 制造过程中采用光脱保护法, 掩模孔径较小时会发生光衍射现象, 制约了探针密度的进一步提高; 光脱保护不彻底, 每步产率(step yield) 只有92% - 94% , 因此这种方法只能用来合成30 nts 左右的寡核苷酸探针. 最近,Wisconsin 大学的Gasson etal[ 13 ]利用投影电视中的数控微镜阵列技术制成了一种无需掩模的高密度芯片原位合成系统——MA S (m ask less array syn thesiz2er)。 用这种方法可以在1.4 cm2 的区域合成480 000 种探针, 单个探针的区域为16 Lm2; 采用分辨率更高的数字微芯片点样系统(digital m icrom irro r array system , DMA S) , 可以在同样大小的区域合成2 000000 种探针。 如果40 种探针代表一个基因, 就可以在一种芯片上合成相当于50 000 个基因的探针。 合成时间较光控原位合成少, 合成成本也低。

3. 1. 2 原位压电打印法(原位喷印合成法)

Incyte Pharm aceu t icals 和Ro set ta B io system Inc 两家公司共同开发了原位压电打印法[ 14 ]. 其技术原理与喷墨打印机相似, 不过有多个喷墨头和墨盒, 墨盒中装的是碱基而不是碳粉. 喷印头可以在整个芯片上移动, 并根据芯片上不同位点探针序列的需要将特定的碱基喷印到经过包被的芯片特定区域上, 然后冲洗, 去保护, 进行寡核苷酸合成的下一个循环。 该技术采用的化学原理与传统的DNA 固相合成一致, 因此不需要特殊制备的化学试剂。

3. 1. 3 分子印章法高密度DNA 原位合成法 

中国东南大学有一项国际专利技术, 即分子印章压印准固相合成技术。 利用该技术东南大学设计了一台原位半自动DNA 芯片的装置. 该方法根据所需要的微阵列设计制备有凹凸的微印章, 然后根据预先的设计在刻好的印章上涂上对应的单核苷酸, 最后按照设计的顺序将涂有不同的单核苷酸的微印章逐个依次压印在同一片上。 然后利用可以自动清洗、脱保护、氧化和封闭等化学反应的液体流动池, 按照预先设计的序列进行DNA 合成, 合成到所需要的序列长度才停止, 合成的DNA 链垂直于基片排列成基因阵列。

3. 2 合成后交联法

与原位合成法相比, 合成后交联法[ 15 ]比较简单, 只需要将预先制备好的寡核苷酸或cDNA 等样品通过自动点样装置点于经过特殊处理的玻璃片或其他材料上即可, 合成后交联法适用于大片段DNA , 有时也用于寡核苷酸, 甚至mRNA。 合成后交联法有两种方法: 接触点加法和喷墨点加法。 喷墨点加法是由B io2do t 公司开发的[ 16 ]; 接触点加法是由Stanford University 的Shalon[ 17 ]及其同事共同研究开发的。 接触点加法针头与芯片接触, 喷墨点加法针头与芯片保持一定距离. 接触点加法的优点是探针密度高, 通常1cm 2 可点加2 500 个探针; 缺点是定量准确性和重演性不好, 针头容易堵塞且使用寿命短。 喷墨点加法定量准确, 重现性好, 使用寿命长; 但斑点大, 探针密度低, 通常1 cm 2 只有400 个探针。

另外还有一种三维芯片[ 18, 19 ] , 是由美国的Packard 公司、Motorola 公司、Argonne 国家实验室与俄罗斯Engelhardt 分子生物学研究所合作开发的一种芯片技术, 也可以认为是合成后交联技术的一种。 这种三维芯片主要是利用官能团化的聚丙烯酰胺凝胶块作为基质来固定寡核苷酸。 这种三维芯片具有明显的优点: 固定的寡核苷酸量比较大, 每一种探针为3- 300 fmol, 是二维芯片样品量的100 倍, 被检测样品DNA 分子可以不带报告分子; 杂交反应快, 防止碱基错配能力显著提高。

4 基因芯片技术在农业上的应用

4. 1 作物基因组测序

DNA 芯片用于序列分析[ 20 ]提出较早, 原理是依靠短的寡核苷酸探针与DNA 杂交, 利用杂交谱重建DNA 序列, 该技术为大规模测序提供了方便、快捷、准确的手段。 测序用的基因芯片包含一定长度核酸的所有可能序列, 一个长度为S 的序列有4S 种可能的核苷酸序列, 包含这4S 种S 核苷酸的芯片可以分析的目标长度大约为点阵上核酸数目的平方根。 例如, 一个含有65 536 个探针的8 核苷酸点阵可被用来测定约200 个核苷酸的序列。 继人类基因组和模式动、植物测序完成后, 农作物大规模测序将拉开序幕。

4. 2 寻找新基因

Schena et al[ 21 ]用包含1 056 个cDNA 的芯片与热休克作用和佛波酯处理的T 细胞的cDNA 杂交, 发现了4 个新基因. 在植物上, 也可以用这种方法发现新基因。 如构建cDNA 文库, 对正常和逆境条件下或野生型与突变体进行杂交筛选, 就可以找出差异表达序列。 以差异序列设计探针可以从文库中钓出相应的克隆, 经测序鉴定就可以确定是否为新基因。

4. 3 基因表达水平检测

DNA 芯片技术应用于基因表达水平的检测的最大优越性是可自动、快速、平行检测目的材料中成千上万个基因的表达情况. Schena et al[ 22 ]采用拟南芥基因组共45 个基因的cDNA 微阵列[ 其中14 个为完全序列, 31 个为表达序列标签(exp ressed sequence tag, EST ) ]检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平。 用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交, 发现该植物根和叶组织中存在2 个基因表达的差异, 而参与叶绿素合成的CA B 1 基因在叶组织较根组织有高达500 倍的表达, 表明基因芯片的检测效率很高。

植物生长发育是一个十分复杂的过程, 涉及到众多基因的表达、调节、控制。 以往的研究局限于某一种或某一类基因的行为和功能, 不能监测该基因或该类基因与其他基因的互作, 无法从整个基因组水平进行研究. 利用基因芯片技术, 可以高通量平行监测基因的表达, 进而推断基因的功能, 这有助于加快植物生长发育机理的研究。 在农业上, 可以利用基因芯片技术, 获得农作物在不同基因型发育阶段、环境等一系列影响条件下基因表达的数据。 对这些数据进行分析, 将有可能从基因型与表现型的角度找出土壤肥力、种子、产量、抗逆性、抗病性、抗虫性之间的关系, 为作物育种提供方便快捷的选择手段, 最终有可能免除费力费时的大田试验。

在林木育种上, 基因芯片技术有潜在的用途。 木质素低的树木有很大的经济价值(如生产纸浆造纸) ,因此选育低木质素品种意义重大. 树木育种周期一般比较长, 早期筛选是关键环节. Shederoff[ 23 ]用反义技术对合成木质素的相关基因进行反义寡核苷酸抑制, 经过繁重的筛选工作, 得到了低木质素含量的品种。利用基因芯片技术可以直接检测木质素相关基因的表达, 简化筛选工作, 提高筛选效率。

4. 4 利用基因芯片技术进行后基因组学研究

基因组测序完成后, 研究未知基因的功能是一个十分诱人的后基因组研究课题。 Standfo rd 大学的Davis 研究小组利用DNA 芯片对酵母缺失突变株进行定量分析以确定酵母全序列完成后新发现的ORF的生物学功能[ 24 ]。 应用基因打靶技术产生许多个ORF 缺失突变株酵母, 并在缺失ORF 旁侧引入20 个核苷酸的标志序列作为缺失ORF 的身份标志, 即所谓的“分子条形码”(molecu lar bar codes)。 分子条形码可与DNA 芯片上的探针杂交, 以便于筛选. 这样ORF 功能测试可通过一次杂交及用同一生长培养条件完成, 大大提高了效率和准确性. 说明作物基因组中未知功能的ORF 可用DNA 芯片来探明, 这在作物育种上具有重大应用价值。

4. 5 转基因农产品检测和植物检疫

基因芯片还可用于转基因农产品检测。 广泛收集用于转基因技术的启动子、目的基因(如抗病基因、抗虫基因等) 和标记基因的EST 序列, 制成基因芯片, 可以对转基因农产品进行检测, 建立转基因农产品国际贸易技术壁垒[ 25 ]。

随着基因组测序方法的改进, 大量植物病害的病原微生物基因组被解码, 许多EST 已经公布. 收集这些EST 制成植物检疫芯片, 可用于植物病害的快速诊断, 在发病前进行有效的防治, 跨区域引种、调种及海关植物检疫等。

5 问题与展望

基因芯片的实际应用领先于人们对这种技术本身的了解, 目前还不清楚液相与固相杂交反应之间的区别. 一些关于基因芯片最基本的问题, 如探针的最佳固定方式, 探针与载体之间连接臂以及探针分子之间的间距对杂交的影响以及影响杂交动力学的因素等还有待于进一步研究。 此外, 如何提高灵敏度也是一个问题。

基因芯片技术在农业上的推广应用主要取决于开发商能否对农业提供合理价格的芯片, 但这只是一个时间问题。 相信在不久的将来, 基因芯片技术将成为农业研究的常规手段, 为农业带来一场新的革命。

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