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基因测定中使用的生物芯片

标签: 基因检测 生物芯片

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生物芯片目前是生物学中的一项关键技术。为了开发生物芯片,科学家和工程师借鉴了计算机产业中的小型化技术、集成化技术、并行处理技术,用来开发适用于进行晶片加工的实验室设备和流程。一般来讲,这些微型芯片上的阵列是由有规则排列的cDNA、寡核苷酸、或蛋白质等样本(sample)所组成的。宏阵列排列(macroarraying)也被称作制作栅格(gridding),就是把大型尼龙过滤器上的cDNA、寡核苷酸、或蛋白质等样本排列起来,以便于通过杂交的方法对它们进行映像(screening);但是对于微阵列而言,样本所占有空间的直径不超过200微米,而且需要进行显微分析。在如此小的空间上面放置如此多的信息,这就使得微阵列具有无法比拟的优势。一个DNA微阵列芯片(也就是基因芯片)只有几平方厘米的大小,却能够容纳几千个样本,每个样本都代表着一类基因。这样一来,人们就有可能设计出一种芯片出来,在单个的这种芯片上可以容纳一个复杂的生物体所具有的所有基因,数目可能达到30000到60000个。

DNA微阵列系统(DNA microarray system,也就是基因芯片)具有多种的用途,可以用于变异分析、基因测序、研究基因表达等。这些微阵列系统把DNA芯片和多种仪器结合了起来,共同对样本进行研究:使用扫描仪来研究信使分子(reporter molecules),使用生物信息工具(bioinformatics tools)对数据进行分析。把从核酸中提取的物质同某种固定的的寡核苷酸进行杂交后,能够轻松地测定某种特定的mRNA在染色体上的表达,或者可以用来检验DNA多态现象。

基因芯片技术也可以用来分析蛋白质。类似于蛋白芯片(ProteinChip)的产品(美国加州弗里蒙特市的Ciphergen Biosystems Inc. 公司生产)能够把蛋白排列在一个经过化学处理的表面上,或是排列在用酶、接受体蛋白、或抗体等进行过生物处理的表面上。也可以利用那些未知分子同表面之间紧密的结合来对它们进行分析,可以使用聚焦的激光能量把它们从附着的表面分离开来,然后根据分子的重量来对它们进行检测。这类芯片可以用来进行免疫测定、研究蛋白质之间的相互反应、或者测量配合基的连接(ligand binding)。

DNA微阵列提供了一种强大的手段,能够同时测定几千个基因表达。通常微阵列分析就是把芯片上固定不变的序列同那些从细胞RNA中提取的cDNA经过杂交处理,这样就可以对cDNA实现荧光标识。这里,“探针”(probe)是指被荧光标识的DNA,“目标”(target)是指固定不变的序列。

对基因表达所进行的微阵列分析包括下面几步:

1)构建阵列。被固定在芯片上的DNA是由cDNA(部分或全部)、染色体DNA或是化学合成的寡核苷酸组成的。

2)探针的准备。RNA是从样本中分离出来的,而cDNA是由反转录酶所复制而成。后一个过程包括对cDNA进行的荧光标识,荧光标识可以用来把不同样本的探针区分开来。

3)探针和阵列的杂交。从两个样本中产生的探针结合起来,这样就可以找到固定阵列的完整序列。如果使用核酸吸纸(nucleic acid blotting)的话,就可以在使用很少的阵列的条件下得出最明显的特征。使用完的探针在进行扫描之前必须洗掉。

4)扫描和探测。杂交后的阵列要用共焦激光扫描器(confocal laser scanner)进行扫描,这种扫描器可以对每一个用来标识探针的荧光染料(fluorescent dyes)进行监测。所扫描到的信息可以用来进行计算机分析和被使用在成像作图中。

5)对数据进行的标准化工作和分析工作。在对每一个荧光标识进行扫描中所对得到的影像可以使用专门的软件进行排列,这样一来样本点(spots)就会有所重叠。样本点的数量和每一个样本的密度也可以被测量出来,而且要把周围物质的密度从中减去。对阵列所进行的控制活动,比如从外界添加序列、添加信使基因(reporter gene)、或者为每个样本作荧光标识等,可以帮助纠正在标识和探测过程中两种荧光标识所不同的地方。一般地说,在两个样本中要让单个基因的信号中包含一部分控制信号。

通过使用基于DNA阵列的技术,人们就可以通过简单的方法来测量不同的基因表达。比如,可以针对一个有机体中的所有基因,同时研究所有这些基因在不同细胞或组织样本中的RNA转录的相对水平。当从两种渠道(比如,从控制方法和患病组织处)获得的特定RNA的水平被测量出来以后,如果使用的是颜色鲜艳的荧光染料(比如蓝色和黄色)来标识每个样本的cDNA探针,那么两个RNA水平之间的差异就很容易被发现。如果在两个组织中同一种基因的表达水平相同,那么计算机就会显示绿色。荧光标识所选用的颜色的不同表明了基因表达所存在的差别。使用微阵列技术所测量到的mRNA转录体的数目可以帮助人们详细了解基因表达所决定的细胞形态的形成过程。DNA微阵列信息使得研究人员能够研究在发病状态下的宿主细胞的基因表达所发生的变化,这些病症是由于抗滤过性病毒感染所引起的,或是由于细胞发生改变而导致了瘤细胞的产生。对这些变化了解得越多、越完全,就越帮助人们了解病毒复制的机理、发病机理、病毒宿主抗病毒反应等越多。

微阵列分析产生了无数的数据集(dataset)。例如,对包括了50000个基因的6个样本在10种条件下所进行的阵列试验,将会产生300百万份原始信息,而通过对样本图像进行比较会使这个数量再增加几倍。如此巨量的数据就必须需要相应地进行大型存储、分析和管理。用于对这类生物信息进行挖掘和存储的系统,最近已经进入了生物信息市场;软件包可以帮助研究人员简化对那些从微阵列分析中所得到的数据的处理过程,可以自动装配原始的图像数据、对其进行测定和转化为可以用于分析和可视的表达信息。

基因表达模式(pattern of gene expression)的分析能够帮助研究人员确定药物作用的机理。例如,cDNA微阵列显示:ferrioxamine(存在于Saccharomyces cerevisiae酵母中的一种铁螯合剂)主要是促进铁的吸收;这其中发挥主要作用的是转录因子Aft1,因为Aft1的基因在铁的作用下会被激活。这个结果帮助科学家进一步认识到,Saccharomyces cerevisiae中存在着两套由Aft1转录因子所决定的基因,这两套基因可以为那些由ferrioxamine所调节的铁吸收提供两种途径。Fet3p,是结合紧密的亚铁传输系统(ferrous iron system)中的一个组成成分,大量出现于质膜中;而Arn3p,由含铁细胞所调节的传输系统(the siderophore-mediated transport system),则大量存在于细胞内的囊中。

巨量的基因表达分析在药物研制过程中发挥着重要的作用。通过使用微阵列技术对染色体表达进行研究,可以对发病细胞的染色体表达模式进行分析,也可以用来确定所研制的新药的疗效。微阵列同样可以帮助人们确定药物是否有副作用或是会和其它的药物发生反应,从而简化对二线药物(secondary drug)疗效的确认与鉴定的过程。

在分子诊断(molecular diagnostics)中也可以应用微阵列。人们使用了微生物染色体序列来作为单个病原体的特定遗传标识,这些标识被排列在一个芯片上,从而形成了一个DNA芯片。然后目标DNA就从临床测试样本中被分离出来,用荧光染料加以标识,然后与DNA芯片上的染色体序列进行杂交,完整的序列和芯片上的探针的序列一起在探针的位置构成了荧光信号。对荧光信号模式的分析能够帮助人们确定所要研究的序列以及在样本中的微生物的序列。微阵列技术还被用来检测癌症细胞中的基因表达,探测乳癌基因BRCA1所发生的变异。研究人员还开发了一种组织微阵列的研究方法(a tissue microarray approach),可以对从1000个肿瘤中提取的样本同时在一片玻璃片上进行分析。这种方法已经被用来检测那些同膀胱癌有关的分子癌变(molecular alteration)。

研究人类染色体核苷的完整序列以及对序列多样性(sequence diversity)进行估计的技术,会对全球人类染色体相对多样性的研究有所帮助。使用微阵列还可以来研究基因表达的全貌、基因种类、变异检测、以及发现新基因等,这些工作已经帮助研究人员更多地了解成千上万的基因的功能,而以前只是了解这些基因的序列。基于微阵列的染色体比较技术也可以用来研究由于微生物感染导致的分子流行病学(molecular epidemiology)。在一项研究中,使用了高密度分支杆菌肺结核寡核苷酸微阵列来研究在微生物隔离种群上发生的已经表现出明显特征的的小规模染色体缺失。在这个研究中还发现,逐渐积累的某种变异同病原体的消失有关。

那些只有一个基是不相同的DNA小片断被称作单核苷多态现象(SNP),这些DNA小片断能够辨别出不同人的基因物质,而微阵列可以对这些DNA片断进行成像。在把包含SNP的寡核苷酸研究对象同固体的表面连接在一起的时候,就可以把几千个SNP固定在同一个芯片上,每一个SNP都有独立、固定的位置。为了确定在人类染色体中存在的是哪一种SNP,可以采取从那个人身上提取DNA同芯片上的进行杂交。如果存在一个特别的SNP的话,染色体探针就会将其标识出来,而在芯片上的那个SNP处就会出现一个正信号。如果这个SNP不存在,就没有任何信号产生。这种方法所存在的一个明显缺点就是:独立的微阵列或芯片必须用来确定每一个SNP的基因型,如果研究的对象比较多的话成本会很高。

借助于OmmiScan设备(美国马萨诸塞州伍斯特市PolyGenyx Inc.公司制造),多个个体的染色体就可以被固定在一个芯片上。这样,SNP探测就包含了对SNP进行杂交,而不是对固体表面的染色体进行杂交。这种方法可以允许研究人员把从超过10000个人身上所提取的染色体DNA排列在一个芯片上同时进行分析。这种同时处理的方法明显地要比单个地处理从多个个体身上所提取的DNA的方法要快。

SNP基因类型的确定和基因药物的出现,最终会导致大规模的基因映像(mass genetic screening)、最适合个人基因类型的“个性化”药物与专用治疗处方的产生,记录在一个生物芯片上的个人遗传信息能够用来确定该人对疾病的易感情况,同时制定出最佳的治疗方法。在不太遥远的将来,微型芯片可以被制成手持诊断设备被放在病人身边和医生的办公室,自动实验室设备能够对病人的染色体进行扫描,判断病人对某一类药物的反应,这样在几分钟之内就可以对每一个病人制定出最理想的疗程。但是在这些技术实现之前,必须解决伴随着遗传映像(genetic screening)而产生的隐私和伦理问题。

微阵列技术,以及遗传映像和监测功能,将会帮助人们逐渐步入到到综合保健的水平,并且使个性化治疗成为可能。

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