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生物芯片技术

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一、生物芯片简介

生物芯片(biochip)是指采用光导原位合成或微量点样等方法,将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面,组成密集二维分子排列,然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交,通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机(CCD)对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析,从而判断样品中靶分子的数量。由于常用玻片/硅片作为固相支持物,且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术,所以称之为生物芯片技术。根据芯片上的固定的探针不同,生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片,另外根据原理还有元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。如果芯片上固定的是肽或蛋白,则称为肽芯片或蛋白芯片;如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探针或DNA,就是DNA芯片。DNA微阵列(DNA Microarray)是目前最重要的一种,有寡核苷酸芯片、cDNA芯片和Genomic芯片之分,包括二种模式:一是将靶DNA固定于支持物上,适合于大量不同靶DNA的分析,二是将大量探针分子固定于支持物上,适合于对同一靶DNA进行不同探针序列的分析。

生物芯片技术是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一,是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术,具有重大的基础研究价值,又具有明显的产业化前景。由于用该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上,所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析,从而解决了传统核酸印迹杂交(Southern Blotting 和Northern Blotting等)技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量(low through-put)等不足。而且,通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值,如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序(Sequencing by hybridization, SBH)等,为"后基因组计划"时期基因功能的研究及现代医学科学及医学诊断学的发展提供了强有力的工具,将会使新基因的发现、基因诊断、药物筛选、给药个性化等方面取得重大突破,为整个人类社会带来深刻广泛的变革。该技术被评为1998年度世界十大科技进展之一。

二、生物芯片的应用领域

1 、基因表达水平的检测

用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。Schena等采用拟南芥基因组内共45个基因的cDNA微阵列(其中14个为完全序列,31个为EST),检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平,用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交,经激光共聚焦显微扫描,发现该植物根和叶组织中存在26个基因的表达差异,而参与叶绿素合成的CAB1基因在叶组织较根组织表达高500倍。Schena等用人外周血淋巴细胞的cDNA文库构建一个代表1046个基因的cDNA微阵列,来检测体外培养的T细胞对热休克反应后不同基因表达的差异,发现有5个基因在处理后存在非常明显的高表达,11个基因中度表达增加和6个基因表达明显抑制。该结果还用荧光素交换标记对照和处理组及RNA印迹方法证实。在HGP完成之后,用于检测在不同生理、病理条件下的人类所有基因表达变化的基因组芯片为期不远了。

2 、基因诊断

从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱,就可以得出病变的DNA信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点,将成为一项现代化诊断新技术。例如Affymetrix公司,把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上,制成P53基因芯片,将在癌症早期诊断中发挥作用。又如,Heller等构建了96个基因的cDNA微阵,用检测分析风湿性关节炎(RA)相关的基因,以探讨DNA芯片在感染性疾病诊断方面的应用。现在,肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。基因诊断是基因芯片中最具有商业化价值的应用。

3、 药物筛选

如何分离和鉴定药的有效成份是目前中药产业和传统的西药开发遇到的重大障碍,基因芯片技术是解决这一障碍的有效手段,它能够大规模地筛选、通用性强,能够从基因水平解释药物的作用机理,即可以利用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异。如果再c DNA表达文库得到的肽库制作肽芯片,则可以从众多的药物成分中筛选到起作用的部分物质。还有,利用RNA、单链DNA有很大的柔性,能形成复杂的空间结构,更有利与靶分子相结合,可将核酸库中的RNA或单链DNA固定在芯片上,然后与靶蛋白孵育,形成蛋白质-RNA或蛋白质-DNA复合物,可以筛选特异的药物蛋白或核酸,因此芯片技术和RNA库的结合在药物筛选中将得到广泛应用。在寻找HIV药物中,Jellis等用组合化学合成及DNA芯片技术筛选了654536种硫代磷酸八聚核苷酸,并从中确定了具有XXG4XX样结构的抑制物,实验表明,这种筛选物对HIV感染细胞有明显阻断作用。生物芯片技术使得药物筛选,靶基因鉴别和新药测试的速度大大提高,成本大大降低。基因芯片药物筛选技术工作目前刚刚起步,美国很多制药公司已开始前期工作,即正在建立表达谱数据库,从而为药物筛选提供各种靶基因及分析手段。这一技术具有很大的潜在应用价值。

4、 个体化医疗

临床上,同样药物的剂量对病人甲有效可能对病人乙不起作用,而对病人丙则可能有副作用。在药物疗效与副作用方面,病人的反应差异很大。这主要是由于病人遗传学上存在差异(单核苷酸多态性,SNP),导致对药物产生不同的反应。例如细胞色素P450酶与大约25%广泛使用的药物的代谢有关,如果病人该酶的基因发生突变就会对降压药异喹胍产生明显的副作用,大约5%~10%的高加索人缺乏该酶基因的活性。现已弄清楚这类基因存在广泛变异,这些变异除对药物产生不同反应外,还与易犯各种疾病如肿瘤、自身免疫病和帕金森病有关。如果利用基因芯片技术对患者先进行诊断,再开处方,就可对病人实施个体优化治疗。另一方面,在治疗中,很多同种疾病的具体病因是因人而异的,用药也应因人而异。例如乙肝有较多亚型,HBV基因的多个位点如S、P及C基因区易发生变异。若用乙肝病毒基因多态性检测芯片每隔一段时间就检测一次,这对指导用药防止乙肝病毒耐药性很有意义。又如,现用于治疗AIDS的药物主要是病毒逆转录酶RT和蛋白酶PRO的抑制剂,但在用药3-12月后常出现耐药,其原因是rt、pro基因产生一个或多个点突变。Rt基因四个常见突变位点是Asp67→Asn、Lys70→Arg、Thr215→Phe、Tyr和Lys219→Glu,四个位点均突变较单一位点突变后对药物的耐受能力成百倍增加。如将这些基因突变部位的全部序列构建为DNA芯片,则可快速地检测病人是这一个或那一个或多个基因发生突变,从而可对症下药,所以对指导治疗和预后有很大的意义。

5、 测序

基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列,这种测定方法快速而具有十分诱人的前景。Mark chee等用含135000个寡核苷酸探针的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体基因组序列,准确率达99%。Hacia等用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差异,结果发现在外显子11约3.4kb长度范围内的核酸序列同源性在98.2%到83.5%之间,提示了二者在进化上的高度相似性。据未经证实的报道,去年有一种不成熟的生物芯片在15分钟内完成了1.6万个碱基对的测定,96个这样的生物芯片的平行工作,就相当于每天1.47亿个碱基对的分析能力!

6、 生物信息学研究

人类基因组计划(HGP)是人类为了认识自己而进行的一项伟大而影响深远的研究计划。目前的问题是面对大量的基因或基因片断序列如何研究其功能,只有知道其功能才能真正体现HGP计划的价值--破译人类基因这部天书。后基因组计划、蛋白组计划、疾病基因组计划等概念就是为实现这一目标而提出的。基因的功能并不独立的,一个基因表达的上调或者下调往往会影响上游和下游几个基因表达状态的改变,从而进一步引起和这几个基因相关的更多基因的表达模式的改变。基因之间的这种复杂的相互作用组成了一张交错复杂的立体的关系网。像过去那样孤立的理解某个基因的功能已经远远不够了,需要我们站在更高的层次全面的理解这种相互关系,全面了解不同个体基因变异、不同组织、不同时间、不同生命状态等的基因表达差异信息,并找出其中规律。生物信息学将在其中扮演至关重要的角色。基因芯片技术就是为实现这一环节而建立的,使对个体生物信息进行高速、并行采集和分析成为可能,必将成为未来生物信息学研究中的一个重要信息采集和处理平台,成为基因组信息学研究的主要技术支撑。比如研究基因生物学功能的最好方式是监测基因在不同组织、不同发育阶段、不同健康状况下在机体中活性的变化。这是一项非常麻烦的工作,但基因芯片技术可以允许研究人员同时测定成千上万个基因的作用方式,几周内获得的信息用其它方法需要几年才能得到。

7、实际应用

在实际应用方面,生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、药物基因组图谱、药物筛选、中药物种鉴定、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防等许多领域。它将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径,为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台,这从我国99年3月国家科学技术部刚起草的《医药生物技术“十五”及2015年规划》中便可见一斑:规划所列十五个关键技术项目中,就有八个项目(基因组学技术、重大疾病相关基因的分离和功能研究、基因药物工程、基因治疗技术、生物信息学技术、组合生物合成技术、新型诊断技术、蛋白质组学和生物芯片技术)要使用生物芯片。生物芯片技术被单列作为一个专门项目进行规划。

三、DNA微阵列技术在癌症机制研究中的应用

在多年的癌症疾病研究中,科学家和医学工作者们认识到,癌症并不只是某一种疾病,在它的背后,隐藏着形形色色,变化多端的种类,有几百种这样的癌症存在着。它们为什么一直难以攻克呢?其主要的原因是由于每一种癌症都有自己的特点,一种药物并不能对各个不同组织的癌症都能产生疗效,有些能抑制住肿瘤细胞,但有些却毫无作用,甚至在病症上相同的癌症,也无法用一种药物达到治疗的目的。现在,有一种新的技术可以帮助我们区分这些癌症,并加以定义,而且还能帮助我们寻找新的治疗药物。

微阵列技术已经将我们带进了癌症的内部世界。一些实验室的研究者们就已经用这种技术鉴定了一些癌症的特定亚型,包括白血病、淋巴瘤、危险的恶性皮肤癌以及乳腺癌。他们从中可以了解目前的治疗方法对哪些癌症是有效的,哪些是没有作用的。麻省理工学院基因组研究中心的一个研究小组曾经宣称,用基因表达谱将癌症进行分类的设想是完全可以实现的(Science,1999)。他们于是开始比较急性髓性白血病(AML)和急性淋巴性白血病(ALL)的基因表达谱。这两种白血病在临床的标准病理检测中难以区分。研究人员从38位ALL和AML患者的骨髓细胞中抽提了mRNA,用生物素进行标记,分别与带有6800个人的基因的芯片(由Affymetrix提供)进行杂交,来检测基因的表达情况。经过计算,挑选出了50个差异表达的基因。这些基因的挑选是依据数学方法。研究小组的领导人Golub说,因为我们开始无法预料哪些基因能提供更多的信息。这个结果表明他们已经可以用这些基因表达谱来区分38个患者中哪些是AML,哪些是ALL。对另一组36个患者也能做出同样的区分。尽管专家们早就知道AML和ALL是两种白血病,“但从表达水平上做出解释仍然是十分必要的。”Jeff Trent说。

从那以后,研究者们纷纷开始用基因表达谱来揭示一些未知的癌症类型。Staudt的研究小组就开展了许多这样的工作。他们与斯坦福大学医学院的Patrick Brown和David Botstein小组合作,研究大面积扩散的B细胞淋巴瘤。这是一种非霍吉金氏病,在美国每年有一万五千多人的发病率,而且临床上变易大,只有40%的患者可以被治愈,60%的患者会死亡。微阵列技术的分析也许可以帮助我们找到答案。

第一阶段的工作成果发表在了Nature上。研究人员制作了一种他们称为"Lymphochip"的芯片,上面排列有18,000个基因,大多数基因在正常和恶性淋巴细胞中都表达。然后,他们从40位患者的组织中分离了mRNA,用荧光标记cDNA,与“Lymphochip”杂交。Staudt说:“我们发现40位患者的基因表达有很大的差异,尽管他们都经过了相同的临床诊断。”

根据计算机分析的基因表达谱结果,可以将40位患者分成两组,一组患者中,发生免疫应答的脾脏和淋巴结的B细胞特征性的表达了一类基因;而另一组患者中,这些基因却没有表达,但在受到抗原刺激后发生分裂的血液中的B细胞表达了另外一类基因。“由此,”Stault说道,“我们认为这些患者得的是两种不同的疾病。”的确,这两组患者的临床检测结果也有所不同,脾-淋巴结B细胞谱的情况要好一些,经诊断后有75%的患者多活了5年,而另一组恰恰相反。Staudt的小组目前正在进行一个称为淋巴瘤-白血病的分子分型的合作研究项目,要对几百个B细胞淋巴瘤患者做出分析,来验证他们的结论。不过,他们已经提出了可能的治疗方案。淋巴瘤患者的治疗首先是要进行化疗,如果有复发情况,就要进行骨髓移植。在以后,那些预后差的患者就可以直接进行骨髓移植,无需作化疗,以免使身体更加虚弱。

DNA微阵列技术并不只用在血液癌症的分类研究。NHGRI小组在Nature上发表了他们黑色素瘤分类的研究成果。通过研究基因的表达谱,他们将31位在肿瘤病理检测中没有差异的黑色素瘤患者分成两类,这两种类型是否能与临床联系起来,还不得而知。但已经有了一些数据表明了其可能性。比如,占多数的患者的表达谱中,相当一些表达下调的基因都与细胞迁移有关。这一点是与肿瘤细胞运动能力的减弱是一致的。这也就意味着肿瘤细胞的扩散能力减弱了。

斯坦福大学的Brown和Bostein还有他们的同事们也在利用微阵列技术寻找乳腺癌的亚类型。他们也得到了两个不同的肿瘤类群。这两类的基因表达差异体现在雌激素受体。这也是在预料之中的,我们早就知道,雌激素受体缺乏的乳腺癌更为严重。但是,他们后来还发现,这类癌症还能细分出许多亚群。例如,带有雌激素受体的一类肿瘤细胞的基因表达谱不仅与哺乳动物的排泄管基细胞十分相似,与另一种高表达Erb-B2肿瘤基因的的细胞也很相似。

这些早期的研究很清楚的表明了利用微阵列技术可以高通量的检测基因的表达,但是,更有意义的结果并不在于我们只知道哪些基因的表达是上调还是下调,而是要鉴定出哪些基因是对癌症的病因和发展紧密相关的。例如,MIT的研究小组在比较高转移黑色素瘤细胞和低转移黑色素瘤细胞的基因表达谱,找到了一组随着肿瘤的恶化表达明显上调的基因。

这些基因中,许多都是参与了癌细胞的转移,直接或间接的影响到细胞的移动和进攻性。例如,MIT的一个研究小组深入的研究了一个称为RhoC的基因,这个基因曾经报道过与胰腺癌的转移有关。他们将这个基因转到人的黑色素瘤细胞(无扩散倾向)中,然后接种到小鼠上,他们发现这些细胞具有高度的转移性。另一项热门的领域是研究人员利用微阵列技术来研究那些激发肿瘤产生的癌基因和抑制肿瘤的癌基因是如何干扰其它基因表达的。

Klausner(MTI)说,微阵列工具可以阐明特定遗传缺陷及如何调控的相互关系。Staudt小组就曾经用Lymphochip来研究BCL-6基因的异常活动的情况,这在淋巴细胞中是很常见的情况。过去,我们知道BCL-6基因的表达产物会抑制某些基因的表达,NCI的研究人员正是想找出其中导致癌发生的变化。他们发现BCL-6基因的活动会导致blimp-1基因表达的抑制,blimp-1基因的功能是促进B细胞的分化,变成一个可以分泌抗体的血细胞。另一个受到影响的基因是p27kip1,它会影响细胞的分裂周期。这两个基因对细胞产生双重作用,使细胞保持在在一个分化停滞,不断分裂的状态。

在西雅图Fred Hutchinson癌症研究中心的Eisenman小组与MIT合作研究Myc基因的活性变化,这项研究结果发表在3月份的PNAS上。他们发现,Myc基因的活性会引起27个基因的上调表达,这些基因中包括一些促进细胞分裂的基因。同时还引起另外9个基因的下调表达。"我们正在发现这些肿瘤的恶化途径,现在我们可以研究这些干预的途径是否有所帮助。

另一块利用微阵列技术研究癌症的热点是癌细胞在化疗下的应答机制,以及哪些癌细胞能够发生应答,而哪些不能。其实,微阵列技术的应用是无穷无尽的。

随着微阵列技术的研究和应用急剧增加,由此而带来的数据象洪水一样"泛滥",我们不得不面对这样一个严峻的问题:怎样处理这些日益增多的数据?仅仅去分析还不够,还要知道怎样去利用和比较它们。而且,不同的研究人员所使用的技术平台和不同的方法,没有一个标准化的尺度,就很难将这些结果统一起来,评定结果的可靠性。

针对这些问题,NCI已经建立了一个基因表达分析工作小组,专门来研究芯片领域中遇到的种种问题,寻找解决方案。尽管我们对微阵列技术的有着极大的研究热情,但最终还是朝着临床的方向发展。

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