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杂交、扫描、图像分解对基因芯片实验的影响

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1.  基因芯片的杂交技术

基因芯片杂交要根据探针的类型、长度以及研究目的来选择优化杂交条件。当用于基因表达检测时,杂交需要高盐浓度、高样品浓度、低温和长时间(往往要求过夜),但严谨性要求则比较低,这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度[1]。目前对于基因芯片的杂交影响因素研究报道不多,主要有以下几方面:1)不同杂交时间的影响:如 Sarto[2]等研究了不同水平的探针浓度和杂交时间对基因芯片杂交的影响,研究发现增加杂交时间从 18小时到 42 小时和 66 小时,杂交质量明显改善,尤其是探针浓度低于理想浓度时,长时间杂交明显增加信噪比、差异表达基因数目和重复芯片的相关性。2)杂交动力学的影响:如McQuain[3]等比较了静态杂交和动力杂交对基因芯片杂交的影响,结果发现动态杂交提高了杂交速度,增加了信噪比和减少了点与点之间的误差。3)PCR 片断的长短及浓度的影响[4]:长的 PCR 片断比短的 PCR 片断获得更高的杂交信号,信号逐渐增强直到 500bp,最佳的点样浓度是 1ng/nl,太低的点样将导致太弱的杂交信号。4)双链 DNA与单链 DNA的影响[5]:单链 DNA比双链 DNA更加敏感, 可能是因为单链有更多编码链可结合到标记的 cDNA 上。5)杂交容量的影响[3]:较大的杂交容量是有利于杂交的,在有盖玻片的小容量内杂交可能会导致杂交液的蒸发,就可能产生很高的背景色,在较大的杂交容量杂交就可避免上述情况。 

2.  基因芯片扫描

当生物芯片和样品探针杂交完毕后,就需要对杂交结果进行图像采集(荧光扫描)和分析。目前专用于荧光扫描的扫描仪根据原理不同大致分为两类:一是基于激光共聚焦显微镜原理的 PMT(Photo Multiplier Tube,光学倍增管)检测系统; 另一种是基于 CCD(charge-coupled
devices,电荷偶合装置)摄像原理的检测系统[4]。

所有的扫描仪都会面临同样的一个问题,即如何将背景降低并提高待测样品的信号。影响扫描质量因素主要有两方面:一是杂交点的质量,如果玻璃片未经过表面化学处理,点样的样品在玻片上结合不牢固,且容易扩散,造成背景高,样品的荧光信号将减弱,干扰信号的读取。此外样点的直径也对扫描结果的读取产生影响,如果点的直径大,荧光分子扩散的范围也大,则观察到的荧光强度相对较弱[6]。二是扫描仪的精度,精密的基因芯片扫描仪要求一个有大的扫描范围、高的扫描速度和多个窄带光谱,这样才可捕获高清晰度、多荧光影像[7]。

调整仪器灵敏度有两种:其一是改变激发光的强度;其二是改变光电倍增管的灵敏度。Lyng[8]等为了制定出合理的扫描程序,研究了不同扫描仪之间基因表达强度、光电倍增管电压和基因表达率之间的关系。结果所有的扫描仪显示有一个 200-50000有限的扫描强度,基因表达率与光电倍增管电压没有直接联系。 但是可用的扫描强度是远远低于光电倍增管的最大检测范围,当高强度扫描时杂交点的像数强度达到饱和,而芯片背景值则会增加,就会导致错误的杂交点与背景强度比值。作者还研究了一种算法来纠正这些杂交点的强度,从而加大扫描可用强度值范围。 建议先增加光电倍增管的电压避免弱杂交点信号在可用扫描强度之下,允许最强杂交点信号达到饱和,然后降低光电倍增管电压,这样获得图像的像数没有达到饱和,使用他们研究的算法就可通过上述两次扫描的图像获得可靠的数值。此外基因芯片结果的波动性部分是因为每次扫描单张芯片得到的图像不是完全一致有关, 为了解决这类问题, Romualdi[9]等提出多次扫描芯片并进行图像整合, 并研制了能将一系列图像综合的软件。他们的研究结果提示该方法能提高差异表达基因的检测率,增加图像的同质性,减少假阳性结果, 并用半定量的 RT-PCR 技术进行了验证。 此外若玻片上有灰尘或其它杂质如衣物纤维、皮屑、指纹等,也将影响扫描结果。

3.  图像分析

图像分析的基本过程是用网格对杂交点的信号进行分解, 接下来从每个网格中提取出真实的目的信号[10]。即定位、分解和信息提取。

3.1 定位过程

即确定杂交点在芯片上的位置,首先对cy3、cy5两张芯片扫描图进行叠加,再确定芯片上的每一个杂交点位置,通常可以使用软件自动化完成,但自动化可能引起图像的旋转、矩阵的偏斜等误差,人工干预可以提高定位的准确性。

3.2 分解过程

分解即前景值和背景值信号强度的分解,最早的方法是立方图法(Histogram)[11],如QuantArray软件等,即在每个点周围化一个圈,一个基于圈内像数强度的立方图就形成了,如果这个像数大于设预值,则被分类为前景值,反之则为背景值。这种方法的主要优势是简单,但前景值没有和杂交点联系起来,结果前景值和背景值可能被过高或过低估计。前景值和杂交点联系起来最简单的方法是以同样的直径在所有杂交点上画圈(GenePix软件等),即固定画圈法(Fixed circle)。当所有杂交点是圆形的和同样大小时,这种方法是可行的;此外还可根据具体的杂交点调节直径的大小,即调整画圈法(Adaptive circle)。但易受点样针头的几何形状、杂交和清洗过程以及边缘效应等因素的影响,如杂交点形状有环状、多边形等。于是研究者使用另外2种调整形状画圈(Adaptive shape)的方法,即分水界(watershed method)[12](Spot软件等)和种子区域扩增法(seeded region growing)[13](AlphaArray软件等)。2种方法都需要起始的像素和光源,临近的像素逐渐地加到原始的光源点(seed)上,直到临近出现较弱的信号为止,即光源点向外扩增是根据光源点像数与周围区域像数值的差异进行的。分水界和种子区域扩增法适合于不同的形状,前景值通常以所有前景值的平均值来确定,这应当与杂交点的RNA、DNA量成正比,背景值的估计通常使用中位数强度。

3.3 信息提取过程 

信息提取即前景值和局部背景值的估计,比如背景值的提取,背景值的确定有不考虑背景强度的方法,这种方法在很多情况下可能是不准确的。局部法是在杂交点周围的小区域确定为局部背景的范围,如ScanAlyze[14]使用杂交点外面和方形盒子内面区域的所有像数作为局部背景。ImaGene和ArrayVision[15]将在杂交点外的2个同轴心圆圈的区域确定为局部背景。Spot[16]和GenePix[17]使用最近杂交点的远距离区域为背景区域,由于直接包围在杂交点周围的像数没有被使用,故理论上讲这种方法不如分解敏感。此外还有全局法,即所有杂交点都减去一个常数背景值。

由于错误的分解像数或者局部的差异和人为因素, 任何局部背景方法可能导致背景值估计高于前景值。Spot软件使用数学形态学开算法(morphological opening)[18]来过滤背景值,过滤有平滑整个芯片图像的作用,结果灰尘和杂交点的高信号值被排除,只留下背景强度。和局部背景相比,这种方法有如下几个优势:首先由于背景估计是基于很大的像数值区域,而且没有受到信号强烈杂交点的干扰,故有更小的变化范围;其次,背景强度的估计是定位于杂交点,而不仅仅是附近;最后背景估计值通常是低于局部背景值,很少产生背景值大于前景值的。

可见不同的方法对背景值的估计效率是不同的,Yang[19]等比较了不同的分解和背景值估计方法,他们发现背景值估计方法比分解方法对于信号强度有更大的影响,与其它方法相比,数学形态学的开算法是更加可靠的背景值估计方法。 可见基因芯片实验的影响因数众多,不同的技术平台、不同的实验室之间都可能存在差异。Wang[20]等人比较了 3 个实验室,3 种技术平台(Affymetrix 基因芯片、cDNA 芯片和核苷酸芯片)间的差异,结果发现在同一实验室内 2 种技术平台间的差异大于同一技术在 2个实验室间的差异。即技术平台的影响大于实验室的影响。Irizarry[21]等人也比较了 3 种技术平台 10 个实验室之间的差异,结果于前者类似,但著名实验室之间的一致性更高。因此深入了解这些影响因数,对于选择恰当的实验方案具有积极的意义。

参考文献

[1] Freeman WM, Robertson DJ, Vrana KE. Fundamentals of  DNA hybridization arrays for gene expression analysis. Biotechniques, 2000,29(5):1042-6, 1048-55.
  [2] Sartor M, Schwanekamp J, Halbleib D, et al. Microarray results improve significantly as hybridization approaches equilibrium. Biotechniques, 2004,36(5):790-796.
  [3] McQuain MK, Seale K, Peek J, et al. Chaotic mixer improves microarray hybridization. Anal Biochem, 2004,325(2):215-26.

[4]  Franssen-van Hal NL, Vorst O, Kramer E, et al. Factors influencing cDNA microarray hybridization on silylated glass slides. Anal Biochem, 2002,308(1):5-17.
  [5]  Kuklin A, Shams S, Shah S. High throughput screening of gene expression signatures. Genetica, 2000,108(1):41-6.
  [6]  Graves DJ, Su HJ, Addya S, et al. Four-laser scanning confocal system for microarray analysis. Biotechniques, 2002,32(2):346-348, 350, 352, 354.
  [7]  Khomyakova EB, Dreval EV, Tran-Dang M, et al. Innovative instrumentation for microarray scanning and analysis: application for characterization of oligonucleotide duplexes behavior. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand), 2004,50(3):217-224.
  [8]  Lyng H, Badiee A, Svendsrud DH, et al. Profound influence of microarray scanner characteristics on gene expression ratios: analysis and procedure for correction. BMC Genomics, 2004,5(1):10.
  [9]  Romualdi C, Trevisan S, Celegato B, et al. Improved detection of differentially expressed genes in microarray experiments through multiple scanning and image integration. Nucleic Acids Res, 2003,31(23):e149.
  [10] Jain AN, Tokuyasu TA, Snijders AM, et al. Fully automatic quantification of microarray image data. Genome Res,2002,12(2):325-332.
  [11] Marzolf B, Johnson MH. Validation of microarray image analysis accuracy. Biotechniques, 2004,36(2):304-308.
  [12] Angulo J, Serra J. Automatic analysis of DNA microarray images using mathematical morphology. Bioinformatics, 2003,19(5):553-562.
  [13] Adams, R., and Bischof, L. Seeded region growing. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence.1994,16, 641-647.
  [14] Eisen, M. B. (1999). ScanAlyze User Manual. Stanford University, Palo Alto. http://rana.lbl.gov. 
  [15] ArrayVision, Imaging Research Inc. http://imaging.brocku.ca.
  [16] Buckley, M. J. (2000). Spot User's Guide. CSIRO  Mathematical and Information  Sciences, Sydney, Australia. http://www.cmis.csiro.au/iap/Spot/spotmanual.htm.
  [17] Wang X, Ghosh S, Guo SW. Quantitative quality control in microarray image processing and data acquisition. Nucleic Acids Res, 2001,29(15):E75-5.
  [18] Soille, P. (1999). Morphological Image Analysis: Principles and Applications. Springer,New York.
  [19] Yang, Y. H., Buckley, M. J., Dudoit, S., et al. Comparison of methods for image analysis on cDNA microarray data. Journal of Computational and Graphical Statistics. 2002,11, 108-136.
  [20]Wang H, He X, Band M, et al. A study of inter-lab and inter-platform agreement of DNA microarray data. BMC Genomics. 2005,6(1):71.
  [21]Irizarry RA, Warren D, Spencer F, et al. Multiple-laboratory comparison  of microarray platforms. Nat Methods. 2005,2(5):345-350

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