3.1、分别加入1/10体积3mol/l NaAc(pH4.5)和等体积5:1酸性酚氯仿溶液,冰浴20min 4℃,11000*g,20min离心。 3.2、吸取上清至一50ml离心管,加入等体积异丙醇,混匀后-20℃放1小时。 3.4、 4℃,1100*g,20min离心,弃上清。 3.5、每管加入3毫升的溶液D,溶解沉淀,再用等体积的酚氯仿各抽提一次。 3.6、加等体积的异丙醇,-20℃沉淀2小时。4℃,10000*g离心20min,弃上清。 3.7、加入10ml冰预冷的75%乙醇,洗涤沉淀2次,晾干沉淀。 4、溶解和比色 4.1、按照0.5ml/g组织的比例加入Milli-Q水200ml,彻底溶解沉淀。 4.2、取适量的样品用10mol/ml的Tris稀释一定倍数,测分光光度值。一般来说ratio(260与280的比值加320系数)值,在1.80—2.00之间比较好。 4.3、配1.0% 的胶,取500ng样品走电泳鉴定。 (二)mRNA的分离与纯化 1、称取一定量的oligo(dT)-纤维素,悬浮于1×上样缓冲液中。 2、将悬浮液装入填有经DEPC处理并高压灭菌的玻璃棉的1ml玻璃注射器中,柱床体积0.5-1ml,用10mlDEPC处理的水冲洗。柱床体积为1ml的oligo(dT)-纤维最大载样量为10mg总RNA,如总RNA的量较少,则应减少柱床体积。 3、用5倍体积的0.1mol/L的NaOH洗柱,然后再用5倍体积的ddH2O冲洗柱子。 4、用10倍床体积的洗脱缓冲液平衡柱子。 5、用10倍床体积的上样缓冲液平衡柱子,备用。 6、用ddH2O溶解RNA样品,68℃水浴3min后迅速插入冰浴中,加等体积的2×上样缓冲液,上样,然后收集流出液。 7、当全部溶液快流干时,将流出液置于68℃水浴3min后,迅速冷至室温后重新上样,并收集流出液。 8、用大量的1×上样缓冲液洗柱,直至OD260值很低或为零。 9、待上样缓冲液快流干时,加洗脱缓冲液洗柱,用1.5ml离心管分管收集,每管约400ul,共收集6管,通常mRNA洗脱峰集中在第2管中,第3管次之,第4管后就很少,而第1管中几乎没有RNA洗脱下来。 10、用分光光度计测OD260值,合并mRNA的洗脱组份。加入1/10 3mol/l NaAc(pH5.2)和3倍体积无水乙醇,混合后-80℃保存备用。 11、用时取出,4℃,12000r/min离心20min,弃上清,70%乙醇洗涤2次,沉淀中温烘干,备用。 |
(三)探针标记与纯化 1、将如下试剂混合: 17ul 25ug 总RNA或1~5 ug mRNA 2、 加热到70℃ 10 min.,冰浴1 min。 3、 将如下试剂混合: 8 ul 5x RT buffer 4、 将上述混合液与RNA + oligo dT 液混合,振荡后冰浴,加入1.5 ul Superscript II。反转录酶,60℃孵育60 min 。 5、 加入1 ul 的Superscript II反转录酶,孵育30 min.后,冰浴1 min。停止反应。 6、 加入1 ul 的0.5M EDTA 和 2 ul 的 2M NaOH.,65℃加热10 min,水解除去RNA。 7、 加入4 ul的1M HCl 和 4 ul 1M Tris pH 8。 8、 加入17 ul的100mM 醋酸纳至各反应管。 9、 使用Qiaquick PCR purification kit纯化。 (四) 杂交及洗涤 1、将如下试剂混合 Cy5+Cy3 probe 30 μl 用microcon 30 filter 浓缩探针混合物,使终体积为12μl或略少 2、芯片先经含有0.5mg/ml鱼精DNA的杂交液在42℃预杂交6h。 3、杂交探针在95℃水浴中变性5 min,14.000 g 离心10min。 |
4、探针加在基因芯片的点样区域上,用盖玻片封片,置于42℃杂交15~17h。 5、用洗涤2×SSC+0.2%SDS冲洗玻片,去除盖玻片。 6、准备两个染色缸,分别装有2×SSC+0.2%SDS,0.1×SSC+0.2%SDS放入60℃水浴锅中。 7、将玻片依次浸入以上两个染色缸中洗涤10min。 8、再将玻片浸入装有0.1×SSC的烧杯中洗涤5min,晾干后扫描。 注意事项:每点的DNA的数量=样本的浓度 × 每点的量 斑点的容量少意味着用于杂交的探针的数量也很少,即使样本的浓度很高。必须努力减少这样的限制。一些因素必须考虑到,除了探针DNA的数量外,还有与目标分子相互补的探针DNA的比例,长短,目标分子的活性,就象用于检测信号方法的灵敏度影响着信号的强度。 杂交信号的浓度是与目标分子活性成比例的,与它的长度成反比,因此目标分子的特殊活性是十分重要的。每次实验的杂交时间也应该精确测量。 (五)图像处理与数据分析 用ScanArray 3000扫描芯片,用Genepix软件分析荧光信号强度, 为了避免信号值过低带来误差,只有那些Cy3或Cy5大于800的点被选出进行后续分析,并根据软件提供的校正系数对整张芯片的荧光信号值进行校正。 对于芯片上各点都采用Cy5/Cy3的比值作为ratio值,ratio值大于2.0或者小于0.5的点被认为是有表达差异的基因,利用芯片上点的管家基因的信号强度值校正芯片之间的差异。使用各种统计软件进行聚类分析等。 主要参考文献: 1、A Concise Guide to cDNA Microarray Analysis ,The Institute for Genomic Research |
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