亲和层析(Affinity Chromatography，AC)是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法。亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等;也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等。

亲和层析技术的最大优点在于.利用它可以从粗提物中经过一些简单的处理便可得到所需的高纯度活性物质。利用亲和层析技术成功地分离了单克隆抗体、人生长因子、细胞分裂素、激素、血液凝固因子、纤维蛋白溶酶、促红细胞生长素等产品，亲和层析技术是目前分离纯化药物蛋白等生物大分子最重要的方法之一。

近几十年来，亲和层析技术发展十分迅速。对于那些分离流程长、浓度低、杂质多、采用常规方法难以进行分离的生物分子来说，亲相层析技术就显示出其独特的优越性。亲和层析在分离、纯化的效率上可以说是最重要的方法之一。

本文讲述了亲和层析的技术要点，介绍了免疫亲和层析、金属离子亲和层析等主要的亲和层析方法，还介绍了各种亲和层析联用技术。

1 亲和层析的一般问题

1.1 配基的选择

将一对能可逆结合和解离生物分子的一方与水不溶载体相偶联制成亲和吸附剂，这样一对生物分子中，被偶联的一方就叫作配基。在实际工作中，究竞选择哪一种物质作配基，要根据分离对象和实验的具体情况而定。纯化酶选择酶的竞争性抑制剂、底物、辅酶和效应剂作配基。纯化酶的抑制剂选择相应的酶做配基。纯化能结合维生素的蛋白质，选择与其专一结合的维生素做配基。纯化激素受体蛋白，选择相应的激素做配基，纯化核酸可以根据核酸与蛋白质的相互作用、脱氧核糖核酸分子中不同互补链之间、DNA和R14A之间杂合作用的关系选择合适的配基。

1.2 载体的选择

将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面(或孔内)即可制备亲和吸附介质，该固体粒子通常称为配基的载体。因此，亲和吸附介质又称亲和载体。作为载体的固体粒子应满足下列要求:(1)具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大;(2)物理

和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长;(3)含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化;(4)粒径均一的球形粒子。常用的亲和层析载体有:琼脂糖凝胶和交联琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺—琼脂糖凝胶、纤维素、多孔玻璃等。其它用于载体的物质还有:聚苯乙烯、淀粉珠、壳聚糖、硅胶等。

1.3 基质活化和偶联

大部份基质在偶联抗体之前，均需要进行化学活化。活化基质通常经过与抗体表面残基的—NH反应将抗体偶联，偶联反应也可通过与抗体表面的一0H、一C00H或一NH进行。

在小配体的亲和色谱中，间隔臂常插在基质和配体之间，以尽量减少空间位阻对蛋白质与其配体相互作用的影响。当配体本身就是蛋白质大分子，因此，空间位阻将不会阻碍抗体与抗原的相互作用。

最常使用的基质活化方法是溴化氰法。用溴化氰活化多糖类基质具有简单、效果好的特点。许多活化好的、稳定的基质已商品化，在仅仅需要少量基质时可以购买。如果基质的需要量大，自己进行活化更为经济。

1.4 洗脱问题

洗脱亲和吸附剂上吸附的物质大多采用非特异洗脱的方法，通过改变洗脱液的PH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质使固定化配基和生物高分子之间的亲和力降低，以至解开生物高分子和亲和吸附剂之间的结合。假如那些纯化对象和亲和吸附剂的亲和力不强，当连续通过大体积的平衡缓冲液时，便可在紧随杂蛋白洗出蜂后，得到纯化对象的组分。对于那些吸附得比较牢固的大分子，必须用较强的酸或碱作为洗脱液。也可以用特异洗脱的方法，利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。另一种洗脱的方法是利用配基通过重氮键或硫脂键连接在载体上的这一特点，当吸附生物大分子以后，可以用还原剂断裂重氮键或断裂硫脂键，从而得到生物大分子和配基的络合物，然后将络合物解离，再分出欲纯化的生物大分子。

2 免疫亲和层析

抗原和抗体的作用具有高度的专一性，并且它们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将抗原或抗体结合到层析剂上，便可有效的分离和纯化各自互补的免疫物质。

2.1 抗体的纯化

抗体在亲和层析试剂中所占地位日趋重要，所以纯化抗体的方法也倍受关注。抗体通常是从血清、杂交瘤上清或腹水中获得。

2.2 抗原的纯化

在蛋白质纯化中用抗体亲和纯化抗原是非常有效的方法。一般纯化倍数可达到1000~10000倍。如果抗体与目的蛋白的结合的特异性得到证明，并且经过洗脱的目的蛋白没有受到可逆的损伤，那么抗体亲和纯化将是理想的蛋白质纯化方法。

抗体亲和纯化的质量很大程度上取决于抗体溶液的纯度，制备亲和柱的抗体既要良好的特异性和活性，又要尽可能的纯。抗体亲和柱的制备是相当昂贵的，其结合容量却相对较低。因此为了节省和提高效率，经常制备的是小而粗的柱子，同时在亲和纯化步骤里要求样品溶液重复几次上样，以便纯化更多的抗原蛋白。此外，较小的柱子也可以减少和限制柱污染和抗体丢失。

2.3 应用举例

免疫亲和色谱在实验室被广泛用于蛋白质的分离纯化，目前IAC在治疗产品大规模生产上的应用受到价格、配体的渗漏和IAC吸附剂抗原结合容量低等问题的限制。

单抗问世后、不少生物技术公司在研制适宜于培养杂交瘤细胞的生物反应器及其培养基，这些大规模生产单抗技术的建立和不断完善将降低IAC吸附剂的价格。

随着新的合成基质和偶联化合物的出现以及对IAC研究的深人，必将使免疫亲和色谱在工业性生产纯化蛋白质的应用逐渐得到发展。

3 金属离子亲和层析

3.1 基本原理

组氨酸的咪唑基团，半胱氨酸的巯基，色氨酸的吲哚基团可提供电子，与金属离子结合。当这些氨基酸残基与金属离子结合后，含这些残基的蛋白质在亲和层析柱中受到阻滞。用螯合剂将金属离子固定在固体表面会减少蛋白质—金属相互反应的自由度，蛋白质也因此不容易失活，在后继的分离纯化过程中仍然保持较高活性。

3.2 固定化金属离子亲和层析柱的制法

将柱子浸没于某种金属离子(如Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、CO²⁺)缓冲液中，直至螯合到固定相上的金属离子和溶液中的金属离子达到平衡。固相载体，通常是多聚物(如交联化的琼脂糖，葡聚糖)，配位体(亚氨基二乙酸，IDA)共价连接.当在缓冲液中浸泡平衡后，经洗涤，可将含有生物活性物质的样品上柱，与固定化金属—配基有亲

和力的分子都将被滞留，其余则流出柱外。

3.3 固定化金属离子亲和层析的优点

和传统的亲和层析相比，固定化金属离子亲和层析具有以下优点:(1)配基稳定性高，不易脱落;(2)金属离子配基价格低廉，再生成本低;(3)可在高盐浓度下操作，从而省去了脱盐的预处理步骤，而且可以减少非特异性吸附;(4)蛋白质洗脱比较容易，采用较低pH或采用竞争性物质如咪唑，EDTA，便可将吸附蛋白解吸下来。

金属离子亲和层析是利用金属离子的络合或形成螯合物的能力来吸附蛋白质的分离系统。目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组氨酸的基、色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合。锌和铜己发现能很好的与组氨酸的咪唑基巯基结合。常用的金属离子有Cu、Ni、Zn、Co等。金属盐的种类和结构，流动相的组成、PH值、离子强度等会影响亲和层析的效果。

金属离子亲和层析具有以下优点[14]:(1)蛋白质吸附容量大，是天然配基结合量的10—100倍:(2)价格便宜，投资低:(3)具有普遍适用性.金属离子配基具有很好的稳定性，吸附容量大，成本很低，且层析柱可长期连续使用，易于再生。

3.4 固定化金属离子亲和层析的缺点

但是，金属离子亲和层析与免疫亲和层析比较起来，对蛋白质的特异性差，会发生非特异性吸附，结合常数K在104~105之间.另外，螯合在亲和载体上的金属离子在操作过程中有可能脱落而混入产品中，严重影响产品质量螯合。

4 拟生物亲和层析

传统的单克隆抗体及天然大分子有高度专一的立体结构，是较为理想的亲和介质，但这些大分子本身需要高度纯化，成本昂贵且生物化学性质不稳定，纯化中难以维持结合活性，近年来发展起来的仿生亲和小分子配基新技术，对于纯化的目标蛋白在组合生物分子库和组合化学分子库中筛选其相应的亲和配基，然后将其固定到支持介质上，这种组合出来的亲和配基比天然生物分子性质更稳定，特异性及重复性更好。

拟生物亲和层析是利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或某特定部位，以人工合成的配基为固定相吸附分离目的蛋白质的亲和层析，尤以氨基酸(包括多肽)亲和层析和染料亲和层析为代表。

4.1 染料配基亲和色谱

染料配基能通过共价链牢固地结合到亲和载体上。染料配基价格低廉，与蛋白质的结合容量大，并且不易为物理或化学物质所降解，因此是一种较为理想的基团特异性配基，如王静云等用染料配基亲和层析纯化了碱性磷酸酶。

S.C.MeLissis等]研究了谷胱甘肽结构类似物亲和吸附剂。所用的染料是二氯三嗪的模拟物，其中活性部分结构与谷胱甘肽类似。用此种亲和吸附剂分别纯化三种作用于谷胱甘肽的酶NAD十、甲醛脱氢酶和谷胱甘肽—S—转移酶，效果良好。

活性染料对蛋白质分子特异性较低且染料配基通常是有毒性的，且与蛋白质会发生非特异性相互作用。透过实验找到一种与特定目的蛋白很好结台的染体配基是可能的，但是产品回收纯度不高，特别是当分离复杂的体系时难度更大。

4.2 多肽亲和层析

多肽是亲和层析纯化生物大分子更有效的配基。因为它只含有一些氨基酸，所以即使脱落进入产物中也不会产生免疫反应。多肽配基与抗体配基比较起来稳定性更好.它们能在GMP条件下进于大规模的无菌生产，这样可以大大降低成本。与金属和染料相比，多肽具有较高的特异性，且通常是无毒的。多肤具有与蛋白质相似的结构，因此它们的作用通常是温和的，因此在分离过程中可以采取温和的洗脱条件，可以避免蛋白质的变性.。

H.Arostova等用碘化的L—酯氨酸与琼脂糖交联制备亲和层析柱纯化猪胃蛋白酶，效果良好。John等合成的双环八肽类似物，对肠促胰酶肽有很好的特异性吸附。

与金属配基和染料配基相比，多肽具有更高的特异性，且通常是无毒性的。由于与蛋白质结构的相似性.它们之间的相互作用通常是温和的，因此在分离过程中可以采用温和的洗脱条件.避免了蛋白质的变性、失活。然而，自然界中存在的与蛋白质等生物大分子有天然亲和性的多肽种类非常有限。因此，必须找到并得到合适的特异性多肽。

组合化学的进一步发展将为这一发展方向开辟道路。

5 亲和色谱和其他技术联用

从发展趋势来看，生物分离技术研究的目的是要缩短整个下游过程的流程和提高单项操作的效率。过程集成(Process Integration)是一般化工加工过程的重要研究方向。有学者指出:生物分离过程高效集成化的含义在于利用己有的和新近开发的生化分离技术，将下游过程中的有关单元进行有效组合(集成)，或者把两种以上的分离技术合成为一种更有效的分离技术，达到提高产品收率、降低过程能耗和增加生产效益的目标。下文文将对一些集成化的亲和层析技术分别进行介绍。

5.1 离子交换—亲和色谱分离纯化

据调查，在单步纯化效果的工艺中有45%是采用亲和技术获得的。而通过离子交换和亲和色谱的配合使用，还可使纯度提高1000倍以上(达98%以上)，进而满足高效分离纯化的生产要求，同时也为现代药物的研制提供了便利。

人脾组织提取物或人胸腺组织提取物经DEAE—52纤维柱作用后的物质泵入抗SSA抗体亲和柱(抗SSA血清的特异性IgG结合到CNBr活化的sephaMse 4B柱)，洗脱物即为可溶性核糖核蛋白SSA，其效果要大大好于单用亲和色谱[26]。

5.2 亲和膜分离技术

亲和膜分离(Afinity Membrane Separation)是将亲和层析与膜分离技术结合起来以提高过程选择性的一项新型分离技术。膜分离是根据分子大小不同来实现分离的，一般相对分子质量相差10倍以上的物系才具有分离作用，因此它还远远不能满足生化分离的需要。而生物亲和作用也存在载体价格昂贵;色谱柱易堵塞和污染等许多难以克服的缺点。亲和膜分离技术，综合了两种方法的优点，而且相互互补克服缺点，具有传质阻力小、压降低、设备体积小、配基利用率高等优点.但在使用过程中存在着膜的污染和膜孔堵塞等现象，这些现象的出现会使膜的分离效率下降、寿命缩短。

亲和膜过滤技术研究的最早报导见于1980年。Patrick Hubert等人将雌二醇作配基连接于水溶性载体Dextran-72000，用于从Pseudomonas testosteroni提取物中纯化酮醇异构酶，截留率为90%，但杂蛋白的截留率也较高，这可能是由于目标产物与杂蛋白形成复合物或配基与杂蛋白结合所致。

5.3 电泳亲和层析技术

电泳亲和层析技术(Electrophoresis Affinity Chromatography)是将电泳与亲和层析相结合形成一种新型制备规模的生物分离技术。其基本思想是利用电场强化扩散过程以加速分离过程的进行，从而避免了亲和层析在分离过程中，由于液相主体中的溶质分子必须经过一系列扩散过程才能进入到固定相颗粒孔内完成吸附或解吸等质量置换反应，且被置换出的物质再由颗粒内扩散出固定相颗粒进入流动相而引起的分离速度缓慢的缺点。刘铮等发现亲和色谱过程施加电场后吸附过程的传质速率加快，动态吸附容量提高。

5.4 生物磁性亲和分离技术

磁性亲和分离技术将磁性介质引入亲和分离技术，已在细胞分离、固定化酶、免疫检测、DNA分离等诸多领域中得到了应用.它可直接从初始样品液体中(无论是浑浊或清亮液)分离目标产物，克服了传统色谱方法需要离心和过滤除杂质的步骤;此外，同亲和色谱一样也具有高的特异性及应用范围广等优点。

5.5 膨胀床吸附层析技术

众所周知，与上游过程相比，生物下游处理过程是一个多步骤、高能耗、低效率的过程。而且，分离的步骤越多，产物的收率就越低，而生产成本则越高。因此，开发高度集成化的新型生物分离技术，用一步或少数几步操作获得过去需要很多步才能达到的效果，是当务之急.传统层析过程的最大不足是不能处理含固体颗粒的料液，20世纪90年代产生的膨胀床吸附技术(Expanded Bed Adsorption.EBA)将固一液流态化技术与层析过程祸合，使吸附和淋洗过程大大加快，细胞碎片等不溶物从顶部排出，实现了离心、过滤和纯化的一体化操作。综上所述，亲和层析联用技术虽然相对来说不是很成熟，但有着广泛的发展前景。