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Western Blot试剂的准备

标签: Western Blot试剂

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1. 30%储备胶溶液:        丙烯酰胺(Acr)             29.0g
           亚甲双丙烯酰胺(Bis)        1.0g
    混匀后ddH2O,37℃溶解,定容至100ml,棕色瓶存于室温。

2. 4×分离胶缓冲液(1mol/L Tris-HCl  PH 8.8)   Tris  18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调PH 8.8,定容至100ml。

3. 4×浓缩胶缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl  PH 6. 8)    Tris  12.1g加ddH2O溶解,浓盐酸调PH 6. 8,定容至100ml。

4. 10%SDS:电泳级SDS 10.0g加ddH2O,68℃助溶,浓盐酸调PH 7.2,定容至100ml。

5. 5×电泳缓冲液(PH 8.3):     Tris       15.2g
                                 甘氨酸    94g 
                                 ddH2O     定容到1000ml
                                 SDS       5g
  先在974ml蒸馏水中加入Tris碱,待溶解完全后,再加甘氨酸,最后加SDS。

6. 10%过硫酸铵(AP):0.1g  AP加ddH2O至1.0ml,4℃保存,要在一周内使用,最好新鲜配制。

7. 2×加样缓冲液:2×SDS加样缓冲液
   0.5mol/L Tris-HCl (PH 6.8)  2ml
   10%SDS                  4 ml
   β-巯基乙醇               1ml
   甘油                      2ml
   1%溴芬蓝                 1ml
   置4℃避光保存

8. TEMED:注意室温较低时TEMED量可加倍,最后灌胶之前再用

9. 转膜缓冲液(Towbin transfer Buffer):   即1×SDS-PAGE

10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) :      NaCl              8.5g
               (12H2O)Na2HPO4     2.9011g
               (2H2O)NH2PO4         0.24g
             加ddH2O定容至       1000ml

11. 封闭液:                          1×PBS中加入                30ml
           5%(V/V)脱脂奶粉           1.5g
       0.02%叠氮钠                0.006g
       0.05%Tween-20              0.015g

12. 漂洗液(PBST):含0.05% Tween-20的PBS溶液
  每1000 ml PBS溶液中加0.5 ml Tween-20

13. 水饱和正丁醇:   正丁醇    50 ml
         ddH2O      5 ml     加入瓶中震荡,使结合,存于室温。
  用时取上面一相加在凝胶上面。

14. 考马斯亮蓝染色法试剂:一般用G250考马斯亮蓝(蛋白定量专用)
染色液: 90 ml甲醇:水(1:1,V/V)和10 ml冰乙酸的混合液中溶解G250马斯亮蓝0.25g,用Whatman 1号滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。(染色液多次回收利用)
         脱色液:90 ml甲醇:水(1:1,V/V)和10 ml冰乙酸的混合液

15. 丽春红S染色色法试剂:2%乙酸,
             0.5%丽春红的水溶液
  脱色液:TBS

16. Aprotinin:为一58氨基碱性多肽,经反复冻融后,会发生集聚,储存液应分装成小份,保存于-20度,每一小份用后应予废弃。

17. PMSF:在溶液中不稳定,应在临用前从储存液中现加于裂解液中。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF,应立即用大量的水冲洗。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。PMSF通常配成10mmol/L浓度储液(1.74或17.4mg/ml溶于异丙醇中)保存于-20度。

18. 显色液:联苯胺显色液(DAB)
     DAB                 2ml
     10%H2O2                   60μl
     PBS(0.1mol/L PH6.4)   10ml

19. 三去污裂解缓冲液
           0.5mol/L Tris-HCl(PH 8.0)          0.785g/100ml
           0.15mol/L  NaCl                    0.8775 g/100ml
           0.02%叠氮钠                       0.02 g/100ml
           0.1%SDS                           0.1 g/100ml

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