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等电聚焦注意事项

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1.等电聚焦后可用一根染色的细线(0.1mm)标出染料前沿的位置;

2.不同品牌的载体两性电解质性质上有细微的差别,使用不同来源的载体两性电解质凝胶时候蛋白质分离样式略有差异,若要获得最好的重复性一般不要更换载体两性电解质的品牌;

3.通常,窄范围的pH梯度可以提高分辨率,但是需要时间也比较常,pH梯度范围为2是较好的选择;

4.由于电源和凝胶冷却系统的限制,最长的凝胶长度为8-10cm,实际上,分别电泳几块不同的pH梯度的凝胶比只电泳一块较长凝胶效果更好;

5.当等电聚焦电泳时间很长时候(〉3000V·h),由于载体两性电解质不稳定造成的阴极漂移将成为严重问题,阴极漂移会破坏pH梯度,尤其是pH8以上的梯度,为了克服此问题,开发了一种较短时间(1600V·h)完成等电聚焦电泳的技术,即非平衡pH梯度电泳,这样可以在高pH范围内聚焦蛋白质,但该方法不能用来测定蛋白质等电点。

6.尿素可以促进蛋白质溶解,并消除蛋白质-蛋白质及蛋白质-脂类相互作用,可增加聚焦速度和提高分辨率,同时抑制阴极漂移,但是也要注意变性蛋白质的等电点可能同天然蛋白有所差异。

7.若蛋白溶液中含有SDS,可加入尿素至终浓度8M,在高浓度的尿素下,SDS同蛋白质的相互作用极小。

8.在变性液中加入2%Triton X-100以保证蛋白质(尤其是膜蛋白)的充分溶解,有些作者推荐使用如CHAPS和Zwittergent3-14等两性离子去垢剂;

9.超薄凝胶(50-500μm)比常用标准等电聚焦更有优势,因为高电场强度和更佳的冷却效果使聚焦速度更快,分辨率更高。

10.在聚丙烯酰胺等电聚焦凝胶中,高分子量蛋白质(〉750kd)常常表现异常的迁移行为,琼脂糖凝胶或琼脂糖-丙稀酰胺凝胶较适用于高分子量蛋白质。

11.考马斯亮蓝染色中,三氯乙酸固定后用0.25%SDS的乙醇:醋酸:水(33:10:57)溶液洗涤凝胶10-30min可以进一步改善染色效果。SDS同载体两性电解质结合后可以更好的去除载体两性电解质。

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