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聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶

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一、目的

同工酶是指能催化同一种化学反应, 但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组 酶。它们是 DNA编码的遗传信息表达的结果。最近的研究表明,同工酶与生物的遗传、生 长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。因此,测定同工酶在理论上和实践上都有重要的 意义。用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶,方法简便、灵敏度高,重现性强,测定结果便于 观察、记录和保存。

过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生 长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此,测定这种酶 的活性或其同工酶的变化情况,可以反映某一时期植物体内代谢的变化。

本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术,分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶,根据酶的生物化学反映,通过染色方法显示出酶的不同区带,以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。通过本实验,主要要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装置、凝胶配制等问题,熟悉所有 的操作过程,另外,对同工酶有一个感性的认识。

二、原理

1.电泳现象

带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动,这种现象称为电泳。 由于带电胶粒或分子中各种成份,所具有的电荷和分子量不同,在电场中将以不同的速 度移动,因而在电泳进行过程中,不同的成份将按照各自的迁移速度得到有效的分离。

2.影响电泳的主要因素

若将带净电荷 q 的粒子放入电场,则该粒子所受到的引力 F 引可用数学式表示如下:

F 引 =E q (1)     式中 E 为电场强度,单位为“伏特/厘米” ,表示电场中单位距离上的电位差。如果这种情况发生在真空中,则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。 但在溶液中,由于电场的牵引力 F 引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力(即摩擦力)F 阻 相对抗,故上述现象不会发生。根本 Stokes 公式,阻力的大小取决于粒子的大小和形状以 及所在介质的粘度:

F 阻 = 6pghn (2)   式中 F 阻是球形粒子所受的阻力,g是球形粒子的半径,h是溶液的粘度,n是粒子移动 的速度。在溶液中,由电场而产生的加速力被阻力所对抗,因此:

E q = 6pghn (3) 整理一下:  pgm n 6 q E = (4)

由此可以看出,粒子移动的速度(n)与电场强度(E)和粒子所带电荷量(q) 成正比, 而与粒子的大小(g)和溶液的粘度(h)成反比。不难想象,非球形粒子(如 DNA)在电泳过程中会受到更大的阻力,即粒子的移动速度还与粒子的形状有关。 即然在一定 pH 条件下,每一分子都具有特殊的电荷(种类与数量)及大小和形状,那 么在一定的时间内它在相同的电场中便应集中到特有的位置上而形成紧密的泳动带。这就是 带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析、鉴定的基本原理。

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