一、目的

学习纤维素薄层层析的操作方法，掌握分配层析的原理。

二、原理

以纤维素作为支持物，把它均匀地涂布在玻璃板上成一薄层，然后在此薄层上进行层析即为纤维素薄层层析。纤维素是一种惰性支持物，它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。层析时吸着在纤维素上的水是固定相，而展层溶剂是流动相。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。

三、实验材料、仪器和试剂

1.实验材料

绿豆芽或萌发小麦种子

2.仪器

烧杯50mL×1；玻璃板5 cm×20cm×1；层析缸；毛细管；喷雾器；研钵。

3.试剂

标准氨基酸溶液：丝氨酸、色氨酸、亮氨酸，分别以0.01mol/L 盐酸配成4mg/mL 的溶液。

纤维素粉（层析用）或微晶型纤维素（层析用）；羧甲基纤维素钠（CMC）。层析溶剂系统：正丁醇（分析纯）：冰醋酸（分析纯）：水=4：1：1（V/V）。显色剂：0.1%茚三酮-丙酮溶液。

四、操作步骤

1.氨基酸的提取

取已萌发好的小麦种子2g（或绿豆芽下胚轴2g），放入研钵中，加95%乙醇4mL 及少量的石英砂，研成匀浆后，倒入离心管中离心3 000r/min、15min，上清液即为氨基酸提取液，用滴管小心吸入点样瓶中备用。

2.制板

取少量羧甲基纤维素钠（约12mg），置研钵中充分研磨，再称取纤维素粉3g 于研钵中研磨，再加入14mL 水研磨匀浆，把纤维素匀浆倒在洗净烘干的玻璃板上，轻轻震动，使纤维素均匀分布在玻璃板上，水平放置风干，用前放入100-110℃烘箱中活化30min。此处羧甲基纤维素钠是起粘合剂作用，它使纤维素粉能较牢固地粘附于玻璃板上，加入量过多会破坏纤维素薄层的毛细作用而使层析速度延缓，加的量过少则粘合不牢固，因此需要注意加量控制。

3.点样

用刀片将薄层板上薄层的左右各边刮削掉0.5cm，以防止“边缘效应”.在纤维素薄板上距一端15mm 处，用铅笔轻轻划出点样记号。样点之间距离1.3cm。用毛细管吸取样品，在记号处点样，样品斑点直径控制在2mm 左右。

4.展层

将薄板有样品的一端浸入已存放展层溶剂的层析缸中，层析溶剂液面不能高于样品线。待展层溶剂走到距薄板顶端0.5-1cm 时取出此薄板（约1-2h），用铅笔在前沿处作一记号后用电吹风吹干。

5.显色

将茚三酮显色剂喷雾在板上，用热吹风吹数分钟，（或置于70~80℃烘箱中烘干）即可观察到紫红色的氨基酸斑点，脯氨酸例外，为黄色斑点。用铅笔圈出氨基酸斑点，量出溶剂前沿的距离及各斑点中心与起点之间的距离，并计算各氨基酸的Rf 值。Rf 值为迁移率（rate of flow,，Rf），在恒定条件下，每种氨基酸有其一定的Rf 值。Rf 值表示为：

根据已知标准氨基酸和Rf 值，与小麦（或绿豆芽）提取液中氨基酸的Rf 值比较，确定提取液中含有哪些种氨基酸。

五.附注

1.在操作过程中，手必须洗净，只能接触薄板上层边角；不能对着薄板说话，以防唾液掉在板上。

2.配制展层剂时，要用纯溶剂，应现用现配，以免放置过久其成分发生变化（酯化）。