一、凝胶过滤色谱：

一般来说，凝胶过滤色谱的结果好坏直接取决于凝胶柱的柱效（每米多少理论塔板数），而影响柱效的因素主要有：

1、凝胶本身性质：

每一种凝胶均有其合适的分离范围，应选择合适的凝胶进行分离。同样分离范围的凝胶颗粒越细的，柱效越高。

2、色谱柱装填的好坏：

凝胶过滤色谱柱装填完后，一般可以用丙酮（或NaCl）测定柱效和峰对称性，一般对于平均颗粒直径在30~34微米的Superose PG、Superdex PG系列凝胶，柱效应在9000以上，而颗粒平均直径在90微米的Sepharose FF凝胶柱效应在3000以上。通常，越是分辨率高的细颗粒凝胶对于装柱的技术要求越高。

除了柱效以外，影响分离的因素主要有：

a、色谱柱的长短，一般较长的柱分离较好，L/D>20。但一般商用色谱空柱长100cm左右，最多可以装到90~95cm高左右，如果仍不能取得满意的分辨率，可以用两根相同的凝胶柱，用SRTC-2接头连接后，可以提高分辨率40%。

分离度正比于柱长的平方根。

b、样品浓度，在蛋白浓度小于50mg/ml并且粘度小于5cP（厘泊）的条件下，样品浓度对于分辨率影响较小。

c、上样体积：

上样体积越小分辨越好，不同的凝胶具有不同的推荐上样体积，如下表：

凝胶类型 推荐上样体积（%Vt）

Sephadex 2-5%

Sepharose 2-5%

Sephacryl HR 1-2%

Superdex PG 1-2%

Superose PG 1-2%

Superdex 0.5%

Superose 0.5%

对于利用Sephadex G25进行蛋白质脱盐的特殊情形，样品量达到柱体积的25%仍可以保证蛋白与盐分开。

d、洗脱流速：

一般较低的流速下（5~10cm/h）分辨率较高，但Superdex PG，Sepharose FF等新型凝胶可以在较高的流速下分离而不致损失分离度。

二、离子交换色谱：

a、凝胶本身的性质：

分辨力 Sepharose FF

DEAE：弱阴离子 Q：强阴离子 选择性有差异

CM：弱阳离子 S：强阳离子 选择性有差异

b、工作缓冲液的pH值：

离子交换依赖于分子所带的电荷，故pH对其影响较大，往往0.2~0.5 pH的改变就足以改变色谱结果，具体对于分离某一种蛋白，那一个pH最合适，需要进行大量的实验摸索。

c、上样量：

一般保持在结合最大容量的20%以下可以获得较好的分辨率。但对于样品体积无限制。

d、梯度形状：

梯度越平缓，分辨率越高，但同时样品越稀。

c、流速：影响不大。

三、疏水作用色谱：

a、疏水凝胶本身的性质：

基架：Sepharose FF

取代基疏水性：Phenyl苯基、Octyl正辛烷基、Butyl正丁基、Ethyl乙基、Iso异丙基均不相同，选择性也不同。

相同的取代基，不同的取代程度：如Phenyl Sepharose 6 FF（Low sub）与Phenyl Sepharose 6 FF（High sub）疏水性不同，选择性也不同。

b、盐类：

一般常使用硫酸铵、硫酸铵，其他盐类也可使用，具体应根据实验情况决定。

c、温度：温度升高，疏水作用增强。

d、pH值：在接近中性的范围内，影响不大。

e、样品体积：无影响。

f：流速：在压力许可下，无明显影响。

g、样品浓度：在粘度不超过5cP下，无影响。

h、梯度：较缓的梯度分辨较好。

四、一些蛋白质的分子量与Stokes半径：

蛋白质 分子量（kD）Stokes半径（nm）

乳清蛋白 12.4 2.01

核糖核酸酶 13.7 1.92

肌红蛋白 17.0 2.00

大豆胰蛋白酶抑制剂 21.5 2.26

碳酸酐酶 31.0 2.35

辣根过氧化物歧化酶 40 3.00

卵清蛋白 45 2.80

血红蛋白（人）64.5 3.08

牛血清白蛋白 70 3.65

酵母醇脱氢酶 150 4.55

血浆铜蓝蛋白 151 4.73

谷氨酸脱氢酶 258 6.00

甲状腺球蛋白 670 8.25

芜菁花叶病毒 3500 ~12.0