前言: NusA融合蛋白表达系统于9年前(1999年)由Davis发明,并在2000年由Novagen首先进行商业化设计和开发,特别推荐用于以NusA作为N端标签时提高在大肠杆菌中难溶的重组表达蛋白的可溶性。NusA融合蛋白表达系统面市至今,已经通过一些高通量表达筛选的评估确认其在可溶性改善方面的有效性。关于NusA融合表达蛋白去除或不去除NusA标签,目的蛋白仍然具有活性的报道也有很多。正是由于NusA标签系统的这种特性,使其成为目前在大肠杆菌表达体系中使用最为广泛的三个融合标签之一(Cabrita,2006)。NusA提高蛋白可溶性的机制一直被研究探讨,已经获得一些认识。本文总结和回顾这些关于NusA系统性能的研究报道。 在众多NusA标签融合蛋白可溶性研究报告中,有三篇文章因为其研究所涉及的蛋白的数量多和异源性范围广而得到研究者的重视。这些研究结果被总结在表1中。其中,Shih等(2002)的研究由于包括了来自四个不同物种的目标蛋白而尤为重要。在Korf等(2005)的研究中,他们发现20℃诱导比30℃诱导的NusA标签蛋白有更好的可溶性。另外,使用NusA系统验证,八个较大分子量蛋白(>70kDa)中的七个得到了可溶性表达,而其它的融合标签(GST,MBP和hexahistidine)系统则只得到了四个可溶性表达的蛋白。
表1. 用大量的目标蛋白评估NusA标签对提高融合蛋白可溶性的作用
b. 可溶性蛋白量大于等于10%即认为该融合蛋白可溶。 c. 纯化后的融合蛋白如果在SDS-PAGE后考染在合适位置出现条带即认为可溶。 Korf等的还发现对于定位于真核细胞细胞器,质膜或者骨架的蛋白,相对于其它标签系统来讲,NusA标签是最好的可溶性表达的选择。Kohl等(2008)也发现只要在20-25℃诱导表达,NusA标签能够大大提高难表达的蛋白比如膜蛋白的可溶性。与Korf等的研究结果一致,Kohl等也发现25℃诱导表达比30℃或37℃诱导表达可以纯化得到更多的NusA融合蛋白。 切除NusA标签获得后保持活性且正确折叠的蛋白
b. 根据NCBI报道预测的全长蛋白分子量 与NusA标签融合且具有活性的蛋白
与这些切除NusA标签后保持活性且正确折叠的蛋白不同,还有很多报道指出目的蛋白在“NusA-目的蛋白”的融合形式时具有很好的活性。比如单链(ScFv)催化活性抗体14D9(Zheng 2003),来自Aequorea victoria的绿色荧光蛋白(Nallamsetty 2006),人二氢叶酸还原酶(Nallamsetty 2006),来自Ensis directus蛏子的精氨酸酶激酶(Compaan 2003),来自B. thuringiensis的修饰δ-内毒素(Kumar 2005),人BCMA跨膜受体(Guan 2006),植物α-双加氧酶1(Liu 2006),以及来自Plasmodium falciparum的b-ketoacyl-acyl载体蛋白合成酶(Lack 2006)等,反映了各种不同背景的蛋白都显示出了与NusA标签融合后的活性。
Houry(1999)等揭示NusA蛋白是分子伴侣GroEL在体内的必须底物。而GroEL与其共作用因子GroES是大肠杆菌唯一的在所有生长条件下必需的分子伴侣系统。Douette等(2005)研究了融合蛋白NusA-UCP1(uncoupling protein 1)的可溶产量。UCP1是一种线粒体膜蛋白。这些作者发现16℃培养时,当GroEL共过表达的情况下,融合蛋白的可溶性有更大的提高。这个结果也表明NusA与分子伴侣途径相作用,从而阻止参与蛋白的聚集。 已有充分的证据证明NusA标签系统能显著提高多种不同来源蛋白的可溶性表达,而这些蛋白在单独表达时往往形成不可溶的包涵体。在一些研究报告中,用蛋白酶切除NusA标签能使目的蛋白仍保持正确折叠和生物学活性;相反,在另外许多报道中也指出当目的蛋白与NusA融合而非切除时,融合蛋白也同样具有活性。NusA标签系统的成功至少部分地是由于其与大肠杆菌分子伴侣系统相互作用的结果。
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参考文献 Cabrita, L.D., et al. 2006. BMC Biotechnol. 6, 12. Compaan, D.M. and Ellington, W.R. 2003. J Exp. Biol. 206, 1545. Davis, G.D., et al. 1999. Biotechnol. Bioeng. 65, 382. De Marco, V., et al. 2004. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322, 766. Douette, P., et al. 2005. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333, 686. Ermolova, N.V., et al. 2003. Protein Expr. Purif. 29, 123. Guan, Z.B., et al. 2006. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 22, 46. Houry, W.A., et al. 1999. Nature 402, 147. Karlsen, O.A., et al. 2005. FEBS J 272, 2428. Kohl, T., et al. 2008. Proteome Sci. 6, 4. Korf, U., et al. 2005. Proteomics 5, 3571. Kumar, S., et al. 2005. J Inverteb. Pathol. 88, 83. Lack, G., et al. 2006. J Biol. Chem. 281, 9538. Li, M. and He, S. 2006. J Biotechnol. 122, 334. Li, M. and Huang, D. 2007. Biotechnol. Lett. 29, 1025. Liu, W., et al. 2006. Plant Physiol. Biochem. 44, 284. Magistrelli, G., et al. 2005. Biochem. Biophys. Res. Commun. 334, 370. Nallamsetty, S. and Waugh, D.S. 2006. Prot. Expr. Purif. 45, 175. Shih, Y.P., et al. 2002. Protein Sci. 11, 1714. Turner, P., et al. 2005. Prot. Expr. Purif. 39, 54. WilkInson, D.L and |
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