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电泳法(三个主要方法)

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电泳法

电泳法是指带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中,于电场的作用下,向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动,使组分分离成狭窄的区带,用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量(%)的方法。

各电泳法,除另有规定外,照下述方法操作。

第一法 纸电泳法

1.仪器装置 包括电泳室及直流电源两部分。

常用的水平式电泳室装置如图,包括两个电泳槽A和一个可以密封的玻璃(或相应材料)盖B;两侧的电泳槽均用有机玻璃(或相应材料)板C分成两部分;外格装有铂电极(直径0.5~0.8cm)D;里格为可放滤纸E的有机玻璃电泳槽架F,此架可从槽中取出;两侧电泳槽A内的铂电极D经隔离导线穿过槽壁与外接电泳仪电源相连。电源为具有稳压器的直流电源,常压电泳一般在100~500V,高压电泳一般在500~10 000V。

2. 操作法

(1) 电泳缓冲液 枸橼酸盐缓冲液(pH3.0)。取枸橼酸 (C6H8O7•H2O)39.04g与枸橼酸钠(C6H5Na3O7•2H2O)4.12g,加水4000ml,使溶解。

(2) 滤纸 取色谱滤纸置1mol/l甲酸溶液中浸泡过夜,次日取出,用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60℃烘箱烘干,备用。可按需要裁成长27cm、宽18cm的滤纸,或根据电泳室的大小裁剪,并在距长度方向一端5~8cm处划一起始线,每隔2.5~3cm处做一记号备点样用。 

(3) 点样 有湿点法和干点法。湿点法是将裁好的滤纸全部浸入枸橼酸盐缓冲液(pH3.0)中,湿润后,取出,用滤纸吸干多余的缓冲液,置电泳槽架上,使起始线靠近阴极端,将滤纸两端浸入缓冲液中,然后用微量注射器精密点加供试品溶液,每点10μl,共3点,并留2个空白位置。干点法是将供试品溶液点于滤纸上,吹干、再点,反复数次,直至点完规定量的供试品溶液,然后用喷雾器将滤纸喷湿,点样处最后喷湿,本法适用于稀的供试品溶液。

(4) 电泳 于电泳槽中加入适量电泳缓冲液,浸没铂电极,接通电泳仪稳压电源档,

调整电压梯度为18~20V/cm,电泳约1小时45分钟,取出,立即吹干,置紫外光灯(254nm)下检视,用铅笔划出紫色斑点的位置。

(5) 含量测定 剪下供试品斑点和与斑点位置面积相近的空白滤纸,剪成细条,分

别置试管中,各精密加入0.01mol/l盐酸溶液5ml,摇匀,放置1小时,用3号垂熔玻璃漏斗滤过,也可用自然沉降或离心法倾取上清液,按各药品项下的规定测定吸收度,并按吸收系数计算含量。

第二法 醋酸纤维素薄膜电泳法

1.仪器装置 电泳室及直流电源同纸电泳。

2.试剂 (1) 巴比妥缓冲液(pH8.6) 取巴比妥2.76g、巴比妥钠15.45g,加水溶解使成1000ml。

(2) 氨基黑染色液 取0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。

(3) 漂洗液 取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml,混匀。

(4) 透明液 取冰醋酸25ml,加无水乙醇75ml,混匀。

3.操作法

(1) 醋酸纤维素薄膜 取醋酸纤维素薄膜,裁成2cm×8cm的膜条,将无光泽面向下,浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中,待完全浸透,取出夹于滤纸中,轻轻吸去多余的缓冲液后,将膜条无光泽面向上,置电泳槽架上,经滤纸桥浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中。

(2) 点样与电泳 于膜条上距负极端2cm处,条状滴加蛋白含量约5%的供试品溶液2~3μl,在10~12V/cm电位梯度下电泳。电泳区带距离以4~5cm为宜。

(3) 染色 电泳完毕,将膜条取下浸于氨基黑染色液中,2~3分钟后,用漂洗液浸洗数次,直至脱去底色为止。

(4) 透明 将洗净并完全干后的膜条浸于透明液中10~15分钟,取出平铺于洁净的玻板上,干后即成透明薄膜,可于分光光度计上测定和作标本长期保存。

(5) 含量测定 未经透明处理的醋酸纤维素薄膜电泳图可按各药品项下规定的方法测定,一般采用洗脱法或扫描法,测定各蛋白质组分的相对含量(1%)。洗脱法 将洗净的膜条用滤纸吸干,剪下供试品溶液各电泳图谱的电泳区带,分别浸于1.6%的氢氧化钠溶液中,振摇数次,至洗脱完全, 于一定波长下测定吸收度。同时剪取与供试品膜条相应的无蛋白部位,同法操作作对照。先计算吸收值总和,再计算各蛋白组分所占比率(1%)。

第三法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白的原理是根据大多数蛋白都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的净电荷,消除了不同蛋白分子的电荷效应,使蛋白按分子大小分离。

1.仪器装置 恒压或恒流电源、垂直板或圆盘电泳槽和制胶模具。

2.试剂

(1)30%丙烯酰胺溶液 取丙烯酰胺60g与亚甲基双丙烯酰胺1.6g,加水至200ml,滤纸滤过,避光保存。

(2)分离胶缓冲液 取三羟甲基氨基甲烷36.3g、加水70ml,用盐酸调节pH值至8.8,加水至100ml。

(3)浓缩胶缓冲液 取三羟甲基氨基甲烷6.0g、加水70ml,用盐酸调节pH值至6.8,加水至100ml。

(4)电泳缓冲液 取三羟甲基氨基甲烷6.0g、甘氨酸28.8g、十二烷基硫酸钠1.0g,加水至1000ml。

3.操作法

(1)制胶 用30%丙烯酰胺溶液-分离胶缓冲液-20%十二烷基硫酸钠溶液-10%过硫酸铵溶液(新鲜配制)-四甲基乙二胺-水(5.0∶1.5∶0.08∶0.1∶0.01∶5.3)制成分离胶液,灌入模具内至一定高度(剩余体积留作制备浓缩胶用),用水封顶,聚合完毕,倾去水层。再用30%丙烯酰胺溶液-浓缩胶缓冲液-20%十二烷基硫酸钠溶液-10%过硫酸铵溶液-四甲基乙二胺-水(0.8∶1.3∶0.025∶0.05∶0.005∶2.4)制成浓缩胶液,灌在分离胶上,插入样品梳(如为圆盘电泳,用水封顶),待浓缩胶液聚合后,小心除去样品梳或水。

(2)对照品和供试品溶液的制备 照各药品项下的规定。

(3)电泳 垂直板电泳:恒压电泳,初始电压为80V,进入分离胶时调至150~200V,当溴酚蓝迁移胶底处,停止电泳。圆盘电泳:调节电流使每管8mA。

4.固定与染色

(1)考马斯亮蓝染色

①试剂 a.固定液 称取三氯醋酸5g,加水200ml溶解后,加甲醇200ml,再加水至500ml。b.染色液 称取考马斯亮蓝R<[250]>0.5g,加水200ml溶解后,加甲醇200ml与冰醋酸50ml,再加水至500ml。c.脱色液 取甲醇400ml、冰醋酸100ml,加水至1000ml,充分混合。d.保存液 取冰醋酸75ml,加水至1000ml,摇匀。

②固定与染色 电泳完毕,取出胶片(条),置固定液中30分钟,取出胶片(条),置染色液中1~2小时,用脱色液脱色至凝胶背景透明后保存在保存液中。

(2)银染色

①试剂

a.硝酸银溶液 取硝酸银0.8g,加水至4.0ml,将此溶液滴加到0.1mol/L氢氧化钠溶液20ml与25%氨溶液1.5ml的混合液中,摇匀,用水稀释至100ml。

b.固定液 取甲醇50ml、37%甲醛溶液54μl,加水至100ml。

c.显色液 取1%枸橼酸溶液2.5ml、37%甲醛溶液270μl,加水至500ml。

d.终止液 取冰醋酸100ml,加水至1000ml。

②固定与染色 胶片浸在固定液中至少2小时后弃去固定液,用水浸洗至少1小时;胶片置1%戊二醛溶液中15分钟后,用水洗2次,每次15分钟;胶片置硝酸银溶液中15分钟后,用水洗3次,每次15分钟;胶片置显色液中,待各带显出后置终止液中。

5.计算

用卡尺或用扫描定位法测量溴酚蓝指示剂和蛋白迁移距离(如为圆盘电泳还应测量染色前后胶条长度,垂直板电泳胶片厚度低于1mm,染色前后胶片长度基本不变)。按下式计算相对迁移率:蛋白迁移距离 脱色前胶条长度 相对迁移率(R'<[m]>)= 脱色后胶条长度/溴酚蓝指示剂迁移距离

(1)分子量 以R'<[m]>为横坐标,标准蛋白的分子量对数为纵坐标,进行线性回归,由标准曲线求得供试品的分子量。

(2)纯度 取胶片(条),置薄层扫描仪,以峰面积按归一化法计算。

(3)结果判断 供试品主成分迁移率应与对照品迁移率一致。

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