A． 实验过程

一、实验原理：

2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。

二、实验步骤：

1.样品的溶解

取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300μl裂解液(1mg蛋白:100μl裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。其中每隔10～15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70μl，—80℃保存。

2.Bradford法测蛋白含量

取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。

取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0μl,5μl,10μl,15μl,20μl 的BSA溶解液，另2管中分别加入2μl的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80μl），然后，各管中分别加入4ml的Bradford液（原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。(测量过程要在一个小时内完成)。例如：

编号 蛋白量（ul）Buffer(ul)Bradford(ml)OD₅₉₅值

1 0 80 4 0

2 5 75 4 0.024

3 10 70 4 0.061

4 15 65 4 0.091

5 20 60 4 0.116

Bt4 2 78 4 0.079

Bt4 4 76 4

转Bt4 2 78 4 0.075

转Bt4 4 76 4

标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为 OD值，X为蛋白含量。a、b通过作图输入数据可知

相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得

OD值测量过程：

比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。

3.双向电泳第一向---IEF（双向电泳中一律使用超纯水）

3.1 水化液的制备

称取2.0mg 的DTT，用700μl水化液储液溶解后,加入8μl 0.05% 的溴酚兰，3.5μl（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。

在含300μg 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340μl，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。

3.2 点样，上胶

分两次吸取样品，每次170μl,按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。注意：胶条使用前，要在室温中平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线齐平。

3.3 IPG聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为20℃）

S1 (30v,12hr,360vhs,step)

S2 (500v,1hr,500vhs,step)

S3 (1000v,1hr,1000vhs,step)

S4 (8000v,0.5hr,2250vhs,Grad)

S5 (8000v,5hr,40000vhs,step)共计44110vhs,19.5小时

其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦

3.4 平衡

用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上吸干（胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条要将两头剪去），再以超纯水冲洗，滤纸吸干（再次冲洗过程也可省略），然后用镊子夹住胶条以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上，放入用来平衡的试管中（镊子所夹的是碱性端，酸性端留有溴酚兰作为标记），用平衡液A，平衡液B先后平衡15min。注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁。

平衡第二次时，在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片，长度与一向胶条的宽度等同，然后吸取煮好的Marker，转入SDS—PAGE胶面上，保持紧密贴合；同样在第二次平衡时，煮5%的琼脂糖10ml。

4.双向电泳第二向---SDS-PAGE

4.1 配胶(两根胶条所用剂量)

分离胶：（T=8% 80 ml）：溶液于真空机中抽气后再加APS和TEMED

30 % 丙烯酰胺储液 21.28ml

分离胶buffer 20ml 10%APS 220μl TEMED 44μl

双蒸水 38.72ml

浓缩胶：（T=4.8% 10ml）

30 % 丙烯酰胺储液 1.6ml

浓缩胶buffer 2.5ml 10%APS 30μl TEMED 5μl

双蒸水 5.9ml

4.2 灌胶

将玻璃板洗净后,室温晾干,然后,将电泳槽平衡好,玻璃板夹好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶,倒入正丁醇压胶,凝胶后(这时会出现三条线),用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再用滤纸除水后,倒入浓缩胶,正丁醇压胶,凝胶后,用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再加入超纯水,用保险膜封好。

4.3 转移

剪两个小的滤纸片，吸取Marker后，放入SDS—PAGE胶面的一端。然后，将平衡好的IPG胶条贴靠在玻璃板上,加少量的5%的琼脂糖溶液在胶面上(琼脂糖凝胶在转移前十几分钟的时候配好,水浴加热溶解,并保持烧杯中水处于沸腾状态,至用之前再拿出来),再将IPG胶条缓缓加入SDS—PAGE胶面,其中不断补加5%的琼脂糖溶液,注意不能产生气泡。

4.4 跑胶

浓缩胶 13mA 分离胶 20mA 共约5.5个小时

5.银染(两根胶条所用剂量)（银染特别注意用超纯水）

5.1 固定 30min 无水乙醇 200ml+乙酸50ml，用超纯水定容至500ml

5.2 敏化 30min 无水乙醇 150ml

Na₂S₂O₃S226;5H₂O 1.5688g

无水乙酸钠 34g

先用水溶解Na₂S₂O₃S226;5H₂O和乙酸钠,再加乙醇,最后定容至500ml

5.3 洗涤 5min × 3次

5.4 银染 20min AgNO₃ 1.25g 用超纯水定容至500ml

5.5 洗涤 1min × 2次

5.6 显影 无水Na₂CO₃ 12.5g 用超纯水定容至500ml

甲醛(37%)0.1ml,临时加

5.7 终止 10min EDTA—Na₂S226;2H₂O 7.3g 用超纯水定容至500ml

5.8 洗涤 5min × 3次

注：整个双向电泳实验中全部使用超纯水，尽量减少离子的影响。

B． 实验相关试剂配制

1． Bradford 工作液

95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考马斯亮兰G250，溶解完后再加磷

85%磷酸 52ml 酸，最后超纯水定容至500ml。过滤后置于棕色瓶

考马斯亮兰G250 0.035g 外加油皮纸保存（Bradford不稳定，一周内有效）

2． 裂解液

尿素 8M

硫脲 2M

CHAPS 4%

DTT 60 mM

Tris—base 40 mM（如果有条件可以添加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate）

3.水化液储液

尿素 8M

硫脲 2M

CHAPS 4%

Tris—base 40 mM

4.分离胶buffer (pH8.8) 250ml

SDS 0.4% 1g

Tris—HCl 1.5M 45.4275g

5.浓缩胶buffer (pH6.8) 100ml

SDS 0.4% 0.4g

Tris—HCl 0.5M 6.07g

6.凝胶储存液（30%的丙烯酰胺）250ml

Acr 29.2% 73g

Bis 0.8% 2g

7.电极缓冲液（跑一次要配制2500ml）

甘氨酸 43.2g 36g

Tris 9g 或 7.5g

SDS 3g 2.5g

超纯水定容至3000ml 超纯水定容至2500ml

8． 0.5M Tris —HCl pH 6.8储液

6.1g Tris先用30ml超纯水溶解，再用46ml，3M HCl调pH6.8,再加水定容至100ml

9． 平衡液储液

脲（即尿素）36g

甘油 30% 30ml

SDS 1% 1g

0.5M Tris—HCl pH6.8 10ml 超纯水定容至100ml

10.平衡液A（一根胶条）

DTT 20mg

平衡液储液 10ml

11．平衡液B（一根胶条）

碘乙酰氨 300mg

平衡液储液 10ml

0.05%溴酚兰 15μl (平衡液A、B均需临时配制)

12．0.5%琼脂糖10ml

琼脂糖 0.05g

电极缓冲液 10ml

溴酚兰 25μl

补：4、5、6的溶液需过滤后储存于4OC备用。

C． 药品

CHAPS 兼性离子去垢剂 去垢剂可破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，

SDS 离子型去垢剂 提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出

尿素 离液剂 可改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质

硫脲 离液剂 变性并使蛋白失活。尿素和硫脲联合使用，可

以大大增加蛋白质的溶解性

DTT 还原剂 断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。但过分提高DTT的浓度，由于它pKa在8左右，因而会影响pH梯度。DTT在碱性pH下会去质子化，等电聚焦时会损耗，导致二硫键复原，蛋白质沉淀

BSA Bradford中制作标准曲线用

无水乙醇 和磷酸一起，提供Bradford中的环境

磷酸 提供Bradford中的酸性环境

Tris 构成缓冲液的成分，可用于抗衡pH的变化

IPG buffer

覆盖液 即矿物油，防止水分蒸发，样品干燥。

丙烯酰胺（Acr） 以丙烯酰胺为单体，甲叉二丙烯酰胺为交联剂，

甲叉二丙烯酰胺 （Bis）在催化剂（Aps）和引发剂（TEMED）作用下，聚合交联成三维网状结构

琼脂糖

溴酚兰 指示剂作用

碘乙酰氨（IAA）平衡液B中使用，中和A液中的DTT

正丁醇 比聚丙烯酰胺密度小，用于凝胶制作过程中的压胶

甘油 无机盐的良好溶剂，热稳定性好

Marker

考马斯亮兰G250（Bradford法用）考马斯亮兰G250有红、蓝两种不同颜色的形式在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定，反应化合物在465~595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色 深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量

甘氨酸 与Tris构成缓冲系统

AgNO₃

EDTA 金属螯合剂，可以结合银离子，终止银染过程。