1、试剂耗材的准备：

（1）转膜缓冲液（48 mM Tris-HCl，39 mM 甘氨酸，0.037% SDS，20%甲醇）：

（2）10 × 丽春红染液：

（3）TBS 缓冲液：

（4）TBST 缓冲液（含20%Tween20 的TBS 缓冲液）：

（5）封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST 缓冲液）：

（6）一抗、二抗及抗体稀释液：参照说明书，以封闭液或TBST 进行稀释。

（7）底物显色液

ECL，4℃ 避光保存，现用现配。

（8）显影液和定影液

用水稀释10 - 20 倍于铝盒中，可多次使用。室温避光存放。

2、实验步骤：

（1）蛋白样品制备：用细胞裂解液抽提蛋白，并测蛋白浓度。

（2）取1 mg 蛋白进行SDS-PAGE。

（3）转膜：（转膜缓冲液4 ℃ 预冷备用，冷却装置于- 80 ℃ 冰箱冷冻备用）。

（4）将2 张海绵垫、2 张滤纸、转膜夹子及玻棒浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。

（5）戴上手套，剪一张与凝胶尺寸相近的PVDF 膜（83 mm × 75 mm），左上角剪一缺口作为标记，浸泡在盛有20 mL 甲醇的平皿中约15 sec，直到膜变半透明。用纯水冲洗膜2 次。浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。

（6）SDS-PAGE 结束后，小心地剥下两块凝胶，一块用于考马斯亮兰染色观察电泳情况，另一块浸泡在转膜缓冲液中预平衡。海绵垫、滤纸、PVDF 膜及凝胶的预平衡时间在15 min - 1 hr 之间。

（7）将转膜夹子打开，使黑的一面保持水平。按照海绵垫、滤纸、凝胶、膜、滤纸和海绵垫的先后顺序铺垫，制备凝胶转移夹层。将膜与凝胶对齐。用玻璃棒赶走气泡。

（8）将夹子夹起来，扣紧，小心不要移动内层。放入电转槽中。使夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。

（9）将电转槽放在冰水盒中。将预冻的冷却装置放入槽内。 缓慢倒入约650 mL转膜缓冲液。

（10）盖好盖子，接上电源。根据蛋白分子量来调节工作电流，一般使用100 V（350mA），转移60 - 90 min。

（11）转膜结束后，断开电源，拆卸转膜夹子，逐一掀去各层。将膜用1 × 丽春红染色5 min，用水冲洗3 次，观察蛋白转印是否完全。同时也可将凝胶用考马斯亮蓝染色，胶上无蓝色条带则说明蛋白转印完全。

（12）免疫反应：

I 封闭：用镊子将膜移至含有25 mL 封闭液的平皿中，用脱色摇床室温缓慢摇匀2 hrs，或4 ℃ 过夜。封闭完用TBST 冲洗5 sec。用吸水纸吸去残余液。

II 一抗孵育：按照一抗说明书的推荐比例稀释一抗，使用TBST 或封闭液稀释。在一容器中，将PVDF 膜浸没在抗体溶液里，室温下2 hrs 或4 ℃ 过夜，摇床缓慢摇匀。

III 一抗孵育完后，用TBST 室温下在摇床上洗3 次，每次10 min。

IV 二抗孵育：同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下摇床缓慢摇匀1 -2 hrs。

V 二抗孵育完后，用TBST 室温下在摇床上洗3 次，每次10 min。

（13）显影和定影：

I 将ECL Plus 显色液的A 液和B 液在容器里体积混合，根据膜的大小来确定显色液的量，1 min 后，将膜与显色液充分接触。

II 反应1 - 5 min 后，吸去膜上残余液，将膜转移至一干净保鲜膜上，包好，放入压片夹中。

III 剪一张比膜尺寸稍大的X 光片，打开压片夹，将X 光片放在膜上，一旦放上，便不能移动。关上压片夹，开始计时。

IV 根据信号强弱调整曝光时间，一般1 - 5 min，也可选择不同时间多次压片以达最佳效果。

V 曝光结束后，打开压片夹，将X 光片迅速浸入备好的显影液中显影，待出现明显条带后，终止显影。一般1 - 2 min（20 - 25 ℃）。

VI 显影结束后，用水冲洗X 光片，放到定影液中，定影时间一般为5 - 10 min，以胶片透明为止。

VII 用水冲洗去底片上残留的定影液，室温下晾干。