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DNA/RNA的提取、纯化与鉴定

标签: DNA提取 RNA提取 常见问题 纯化 基因组DNA mRNA

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一、细菌培养物的生长
从琼脂平板上挑取一个单菌落,接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长),然后从中纯化质粒,质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体(如pUC系列)都能复制到很高的拷贝数,惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期,就可以大量提纯质粒。此时,不必造反性地扩增质粒DNA。然而,较长一代的载体(如pBR322)由于不能如此自由地复制,所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时,以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成,结果阻止了细菌染色体的复制,然而,松弛型质粒仍可继续复制,在若干小时内,其拷贝数持续递增。这样,像pBR322-类的质粒,从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同,前者大为增高。多年来,加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素(μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量,对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
二、细菌的收获和裂解
细菌的收获可通过离心来进行,而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种,这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于3个因素:质粒的大小、大肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。 尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际,但仍可据下述一般准则来选择适当方法,以取得满意的结果。
1、大质粒(大于15kb)  容易受损,故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中,然后用溶菌酶和EDTA进生处理,破坏细胞壁和细胞外膜,再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
2、可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后,有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂,通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对,故可使宿主的线状染色体DNA变性,但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时,质粒DNA链迅速得到准确配置,重新形成完全天然的超螺旋分子。
3、一些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株) 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类,当随后用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类,而糖类可抑制多种限制酶的活性。 故从诸 如HB101和TG1等大肠杆菌菌株中大量制备质粒时,不宜使用煮沸法。
4、当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株(endA+株,如HB101) 中小量制备质粒时,建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A,以后在温育(如用限制酶消化)时,质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚:氯仿进行抽提)可以避免此问题。
5、目前这一代质粒的拷贝数都非常高,以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而,某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量,而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。 大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物,处理起来煞为费事,而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA 的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。
三、质粒DNA的纯化
  常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如,用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。 溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合,进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加,作为补偿,将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后,超螺旋度大为增加, 从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限,可继续结合更多的染料,直至达到饱和( 每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子) (Cantor 和Schimmel,1980)。由于染料的结合量有所差别,线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来,氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时,为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。尽管这些方法大多数均被束之高阁,但其中最好的方法,也应是聚乙二醇分级沉淀法,最近已得到改进(R.Treisman,个人通讯)并达到较高境界, 使用该方法可得到极高纯度的质粒。聚乙二醇分级沉淀法与氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法有一点不同,那就是不能有效地把带切口的环状分子同闭环质粒DNA分开,因此, 纯化容易带上切口的极大质粒(大于15kb)及用于生物物理学测定的闭环质粒时、平衡离心仍是首选的方法。 然而, 两种纯化方法都可得到足可胜任分子克隆中各种复杂工作的质粒DNA,包括用于哺乳动物细胞的转染以及利用外切核酸酶产生成套的缺失突变体。
  可幸,对于更常规的操作,则可全然免却进一步提纯的问题。目前所用的质粒大多数复制量大,小量制备质粒即可得到足量的DNA完成以下种种工作; 限制酶图的绘制、细菌转化、特定DNA片段的分离、常规亚克隆及放射性标记探针的制备。
四、质粒DNA的小量制备
一)细菌的收获和裂解
1、收获
1)将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml 并通气良好(不盖紧)的试管中,然后接入一单菌落,于30℃剧烈振摇下培养过夜。
2)将1.5ml培养物倒入微量离心管中,用微量离心机于4℃以12000g离心30秒,将剩余的培养物贮存于4℃。
3)吸去培养液,使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连,轻缓抽吸,并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时,尽可能使吸头远离细菌沉淀,然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。
2、煮沸裂解
该法根据Holmex和Quigley(1985)的方法改进而成。
1)将细菌沉淀[收获细菌和步骤3)所得]重悬于350μlSTET中。
STET
0.1mol/L NaC
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
5% Triton X-100
2)加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制],振荡3秒钟以混匀之。如果溶淮中pH低于8.0,溶菌酶就不能有效发挥作用。
3)将离心管放入煮沸的水浴中,时间恰为40秒。
4)用微量离心机于室温以12 000g离心10分种。
5)用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。
6)在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠(pH5.2)和420μl异丙醇,振荡混匀,于室温放置5分钟。
7)用微量离心机于4℃以12 000g离心5分种,回收核酸沉淀。
8)小心吸去上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连,轻缓抽吸,并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时,尽可能使吸头远离核酸沉淀,然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。
9)加1ml70%乙醇,于4℃以12 000g离心2分钟。
10)按步骤8)所述再次轻轻地吸去上清,这一步操作要格外小心,因为有时沉淀块贴壁不紧,去除管壁上形成的所有乙醇液滴,打开管口,放于室温直至乙醇挥发殆尽,管内无可见的液体(2-5)分钟。
11)用50μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡,贮存于-20℃。
i.当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株(endA+株,如HB101 )中小量制粒DNA时,建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A,以后在Mg2+存在下温育(V中用限制酶时)质粒DNA可被降解。 在上述方案的步骤9)之间增加一步,即用酚:氯仿进行抽提,可以避免这一问题。
ii.此法制备的高考贝数质粒(如Xf3哉pUC),其产量一般约为:每毫升原细菌增减物3-5μg。
iii.如果要通过限酶切割反应来分析DNA,可取1μlDNA溶液加到另一个含8μl水的微量离心管内,加1μl 10x限制酶缓冲液和1单位所需限制酶,在适宜温度温育1-2小时。将剩余的DNA贮存于-20℃。通过凝胶电泳分析经限制酸消化的DNA片段。如果小量制备的DNA不被限制酶切开,很有可能在收获细菌的步骤3)或上述步骤8)未能很好地去除所有液体。这种情况下,可用酚:氯仿抽提DNA终产物,然后用乙醇重新沉淀DNA,通常,用5-10倍过量的酶(特别是并不昂贵的酶)在100-200μl 体积中进行消化,可以克服限制酶切割反应遇到切割反应遇到的困难。消化后, 加0. 1 体积3mol/L乙酸钠(pH5.2)和2倍体积乙醇沉淀DNA。
(二)质粒DNA小量制备的问题与对策
裂解和煮佛法都极其可靠,重复性也很好,而且一般没有会么麻烦。多年来,在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中,只碰到过两个问题:
1)有些工作者首次进行小量制备时,有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割,这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下,用酚:氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在,可用离心柱层析注纯化DNA。
2)在十分偶然的情况下,个别小时制备物会出现无质粒DNA的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。
五、质粒DNA的纯化
(一)聚乙二醇沉淀法质粒DNA
这里介绍的方法(R.Tresman,个人通讯)已卓有成效地用于纯化碱裂解法制备的质粒DNA。
1)将核酸溶液[上页步骤9)所得]转入15mlCorex 管中, 再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液,充分混匀,用Sorvall SS34 转头(或与其相当的转头)于4℃下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA。
2)将上清转移到另一30mlCorex管内,加等量的异丙醇, 充分混匀, 用SorvallSS34转头(或与其相当的转尖)于室温以10 000转/分离心10分钏, 回收沉淀的核酸。
3)小心去掉上清,敞开管口,将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70%乙醇洗涤沉淀及管壁,流尽乙醇,用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴,敞开管口并将管侄置,在纸巾上放置几分钟,以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。
4)用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml )的TE(pH8.0)溶解沉淀,将溶液转到一微量离心管中,于室温放置30分钟。
5)加500μl含13%(w/v)聚乙二醇(PEG 8000)的1.6mol/L NaCl,充分混合,用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟,以回收质粒DNA。
6)吸出上清,用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚:氯仿、氯仿各抽1次。
7)将水相转到另一微量离心管中,加100μl 10mol/L乙醇铵,充分混匀,加2倍体积(约1ml)乙醇,于室温放置10分钟,于4℃以12 000g离心5分钟,以回收沉淀的质粒DNA。
8)吸去上清,加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。
9)吸去上清,敞开管口,将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。
10)用500μlTE(pH8.0)溶解沉淀1:100稀释[用TE(pH8.0)] 后测量OD260,计算质粒DNA的浓度(1OD260=50μg质粒DNA/ml), 然后将DNA贮于-20℃。
(二)氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA
1、连续梯度
1)测量DNA溶液的体积,按lg/ml的用量精确地加入固体CsCl, 将溶液加温至30℃助溶。温和地混匀溶液直到盐溶解。
2)每10mlDNA溶液加入0.8ml溴化乙锭溶液(10mg/ml溶于水);立即将溴化乙锭溶液(漂浮在表成)与DNA-氯化铯溶液混匀, 溶液的终密度应为1.55g/ml(溶液的折射率为1.3860)溴化乙锭浓度应为大约740μg/ml。溴化乙锭贮存液应贮存于避光容器内(如用锡箔完全包裹的瓶子)。于室温保存。
3)于室温用Sorvall SS34头(或与其相当的转头)以8000转/分离心5分钟, 浮在溶液上面的水垢状浮渣是溴化乙锭和细菌蛋白所形成的复合物。
4)用巴斯德吸管或带大号针头的一次性注射器将浮渣下的清亮红色溶液转移到适用于Beckman Ti65重直转头或Ti50、Ti65或Ti70 角转头(或与它们相当的转头)的离心管(Beckman Quick-seal或与之相当的离心管)中。用轻石蜡油加满管的其余部分并封口。
5)于20℃对所得的密度梯度以45 000转/分离心16小时(VTi65 转头)、 以45000转/分离心48小时(Ti50转头)、以60 000转/分离心24小时(Ti65转头)或者以60 000转/分离心24小时(Ti70.1转头)。在普通光照下,在梯中心可见两条DNA区带, 上部区带材料通常较少,由线状的细菌(染色体)DNA和带切口的环状质粒DNA组成:下部区带则由闭环质粒DNA组成。管底部深红色的沉淀是溴化乙锭RNA复合物,位于CsCl溶液和石蜡油之间的是蛋白质。BeckmanQuick-Seal离心管中的CsCl-溴化乙锭梯度可容纳4mg 闭环质粒DNA而不至超负荷。如有更大量的质粒存在,将扩展为一条宽带,并与染色体DNA相重叠。这种问题只有在质粒复制达到极高水平时才会出现,只要将该质粒提取物分为2个梯度即可解决。如出现负荷,可收集整个DNA区高水平时才会出现,只要产将该质粒提取物分为2个梯度即可解决。如出现超负荷,可收集整个DNA区带,用CsCl溶液(ρ=1.58g/ml)将体积调到15ml,在两个离心管中再度离心,使DNA达到平衡。
6)收集DNA带。将21 号皮下注射针头插入管的顶端以使空气进入,为尽量减少污染的机会,首先用18号皮下注射针头按下述方法收集上部的区带(杂色体DNA):用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂,然后用一块Soctch胶带贴于管外壁。穿过Soctch胶带将18号皮下注身针头(其斜面向上)斤插入管中,以便使针头的斜面开口恰好位于染色体DNA区带之下并与该区带相平行。将粘稠状DNA收集到一次性使用的管内,用造型粘土块封信皮下注射针头的未端并将第2根针头留于原处。 穿过Soctch 胶带插入第3根皮下注射针头(18号),将下部的质粒DNA区带收集到玻璃或塑料管中。
2、不连续梯度
该方法是将含不同浓度CsCl的溶液分层加到离心管中,这样可以加速CsCl梯度的形成,使离心时间减少到6小时。
1)将125gCsCl加到167ml(pH8.0)中,制成CsCl溶液(ρ=1.47g/ml)。
2)将8ml氯化铯溶液加到Beckman Quick-Seal 离心管(或与其相当的管)中,搁置一旁等步聚8)使用。
3)如有必要,可酌情用TE(pH8.0)将质粒DNA溶液的体积精确地调到3ml。
4)在质粒DNA溶液中加入8.4gCsCl,将溶液加温至30℃以促进盐溶解, 小心地混匀溶液直至盐溶解。
5)称量溶液重量并加入TE(pH8.0)直到溶液重量恰好达13.2g,用天平称量时应注意去除管的重量。
6)加入0.8ml溴化乙锭溶液(10mg/ml溶于水),快速混匀溶液直至染料均匀地分散,此时溶液瓣体积应大约为7.5ml。溴化乙锭贮存液应于室温贮存在避光容器中(如完全用锡箔包裹的瓶子)。小心:溴化乙锭是一咱强诱变剂,并在中度毒性。接触含有该染料的溶液应戴手套。
7)于室温用Sorvall SS34转头(或与之相当的转法)以8000转/ 分离心5分钟,浮在液面上的水垢状浮渣是溴化乙2锭和细菌蛋白所形成的复合物。
8)将-22.86cm的巴期德吸管放入装有步骤2)制备的CsCl的离心管中, 吸头应接触管底。用吸管小心地将步骤7)所制备的清亮红色溶液(来自浮渣之下)加入管内,使样本层位CsCl溶液(1.47g/ml)之下。如有必要,可酌情步骤1)中制备的CsCl溶液(ρ=1.47g/ml)添满离心管,封口。
9)将封口的管,(与相应的平衡管一起)放入Beckman Ti70. 1 或Sorvall65.13转头(或与之相当的转头中),于20℃以60 000转/分将密度梯度离心6小时。
10)回收闭环质粒DNA区带
(三)从经过纯化的质粒DNA中去除溴化乙锭
下面方法对于从经过氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心纯化的DNA中去除溴化乙锭都同样奏效。
方法:有机溶剂抽提
小心:溴化乙锭是一种强诱变剂,并有中度毒性。接触含有该染料的溶液应戴手套。用后这些溶液应用后述的方法进行净化处理。
1)将DNA溶液放入玻璃或塑料管中,加等体积的水饱和1-丁醇或异戊醇。
2)振荡混合两相。
3)用台式离心机于室温以1500转/分离心3分钟。
4)用巴期德吸管将下层水相移至一干净的玻璃或塑料管内。
5)反复抽提[步骤1)-4)]4-6次直到粉红色从水相和有机相中均消失。
6)用以下任意一种方法从DNA溶液中除CsCl:通过微量浓缩器(Amicon)进行旋转透析,对TE(pH8.0)透析24-48小时,并换液数次或者用3倍体积水进行稀释并于4℃用2倍体积乙醇(即终体积相当于原未稀释体积的6倍)沉淀D15分钟,再于4℃以10 000g 离心15 分钏, 将沉淀的DNA溶于约1ml TE(pH8.0)中。如将DNA的乙醇溶液置于-20℃,CsCl会沉淀。
7)测定DNA终溶液的OD260值,计算DNA的浓度, 将DNA分成小份贮存于-20℃。如果终制备的DNA含有显著量的溴化乙锭(依颜色判断),可用酚、酚:氯仿各抽提1次,然后用乙醇沉淀DNA。
(四)溴化乙锭溶液的净化处理
小心:溴化乙锭是强诱变剂,并有中度毒性,取用含有这一染料的溶液时务必戴上手套,这些溶液经使用应按下面介绍的方法进行净化处理。
1、溴化乙锭浓溶液(即浓度>0.5gm/ml的溴化乙锭沉溶液)的净化处理
方法: 用少门氏菌-微粒体测定表明, 本方法(Lunn 和Sanaone,1987)可使溴化乙锭的诱变活性降低至原来的1/200左右。
1)加入足量的水使溴化乙锭的浓度降低至0.5mg/ml以下。
2)加入0.2体积新配制的5%次磷酸和0.12体各新配制的0.5mol/L 亚硝酸钠,混匀。
切记:检测该溶液的pH值应小于3.0。市售次磷酸一般为50%溶液,具有腐蚀性,应小心操作,必须现用现稀释。亚硝酸钠溶液(0.5mol/L)应用水溶解34.5g亚硝酸钠并定容至终体积500ml,现用现配。
3)于室温温育24小时后,加入大大过量的1ml/L碳酸氢钠。至些, 该溶液可予丢弃。返回切记:检测该溶液的pH值应小于3.0。市售次磷酸一般为50%溶液,具有腐蚀性,应小心操作,必须现用现稀释。亚硝酸钠溶液(0.5mol/L)应用水溶解34.5g亚硝酸钠并定容至终体积500ml,现用现配。
3)于室温温育24小时后,加入大大过量的1ml/L碳酸氢钠。至些, 该溶液可予丢弃。
(五)从质粒DNA制品中去除RNA
对于某些用途(例如用BAL31进生活化或用T4噬菌体多核苷酸激酥标记质粒DNA的限制切片段的5'端),必须获得无RNA污染的DNA制品。尽管在通过氯化铯-化乙锭梯度平衡离心所制备的质粒DNA中,这样的RNA污染物的重量微不卟道,但对说来,其中的RNA分子数却可能相当可观,并可在限制酶消化反应的全部5'端中占据砂容忽视的比例。通过下述方法,可以从质粒制品中去除RNA 。
1、通过Bio-Gel A-150m或Sepharose CL-4B进行层析
1)制备质粒DNA。
2)有等体积的经TE(pH8.0)平衡后的酚抽提1次。
3)将至多1ml的水相铺在经TE(pH8.0)和0.1%SDS平衡的Bio-Gel A-150m或Sepharase CL-4B(1x10cm)柱上。
4)将DNA装入层柱并在柱的上部连接上含0.1%SDS的TE(pH8.0)的贮液瓶,立即开始以0.5ml流出液为1流进行收集。
5)当收集到15份时,关闭柱底部,为明确质粒DNA的分布情况,可心众每份收集物中取10μg样品,通过0.7%琼脂糖凝胶电泳或溴化乙锭荧光(见附录E)进行分析。
6)将含质粒DNA的组成合并在一起,加2倍体积的乙醇于4℃沉淀10分钟,然后于4℃以大于10 000g离心15分钟,以回收DNA。

基因组DNA的提取编辑本段回目录

  基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇,基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出,而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。
  不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同,分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。

  制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤,通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法,其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式:异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等

试验步骤:

1、贴壁细胞用胰酶消化,离心收集。

2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次,离心收集。试验步骤2再重新作一边。

3、加入5mlDNA提取缓冲液,(10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混匀。

4、加入25ul蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml混匀,50℃水浴3h

5、用等体积的酚抽提一次,2500rpm离心收集水相,用等体积的(酚,氯仿,异戊醇)混合物抽提一次,2500r/min离心收集水相

6、用等体积的氯仿,异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL混匀,冰浴,10min.。

7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。

2500rpm离心10min。弃上清。

8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。

9、12000r/min室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。

从植物组织提取基因组DNA 编辑本段回目录

  一、材料
  水稻幼苗或其它禾本科植物,李(苹果)幼嫩叶子。
  二、设备
  移液器,冷冻高速离心机,台式高速离心机,水浴锅,陶瓷研钵,50ml离心管(有盖)及5ml和1.5ml离心管,弯成钩状的小玻棒。
  三、试剂
  1、提取缓冲液Ⅰ:100mmol/L Tris•Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。
  2、提取缓冲液Ⅱ:18.6g葡萄糖,6.9g二乙基二硫代碳酸钠,6.0gPVP,240ul巯基乙醇,加水至300ml。
  3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇
  4、 RnaseA母液:配方见第一章。
  5、其它试剂:液氮、异丙醇、TE缓冲液,无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。
  四、操作步骤:
  (一)水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取
  1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。
  2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。
  3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤),室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
  4. 室温下5000rpm离心5分钟。
  5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。
  6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。
  7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上,以帮助溶解。
  8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管。
  9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响,可省略该步骤)。
  10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。
  11. 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。
  12. 将DNA重溶解于1ml TE, -20贮存。
  13. 取2μl DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。
  [注意] 5g样品可保证获得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。
  (二). 从李(苹果)叶子提取基因组DNA
  1. 取3-5克嫩叶, 液氮磨成粉状。
  2. 加入提取缓冲液Ⅱ10ml, 再研磨至溶浆状。10000rpm, 10min。
  3. 去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混匀。65℃, 30-60min, 常摇动。
  4. 同(一)中步骤3-13操作。

从动物组织提取基因组DNA编辑本段回目录

  一、材料
  哺乳动物新鲜组织。
  二、设备
  移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。
  三、试剂
  1、分离缓冲液:10mmol/L Tris•Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。
  2、其它试剂:10% SDS,蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂),乙醚,酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),无水乙醇及70%乙醇,5mol/L NaCl,3mol/L NaAc,TE。
  四、操作步骤:
  1. 切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。
  2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。
  3. 加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。
  4. 加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37℃保温1-2小时, 直到组织完全解体。
  5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm离心数秒钟。
  6.取上清液于新离心管,用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm离心 5分钟。
  7. 取上层水相至干净离心管, 加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。
  8. 移去上层乙醚,保留下层水相。
  9. 加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟,DNA沉淀形成白色絮状物。
  10. 用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保存。
  11. 如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温30分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10重沉淀DNA。

细菌基因组DNA的制备 编辑本段回目录

  一、材料
  细菌培养物。
  二、设备
  移液管, 高速冷冻离心机, 台式离心机,水浴锅。
  三、试剂
  1、CTAB/NaCl溶液:4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。
  2、其它试剂:氯仿:异戊醇(24:1),酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),异丙醇,70% 乙醇,TE,10% SDS,蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂),5mol/L NaCl。
  四、操作步骤:
  1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。
  2. 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。
  3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。
  4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。
  5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。
  6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。
  7. 加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟,沉淀DNA。
  8. 用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。
  9. 如要除去其中的RNA, 可以上一节的操作步骤处理。

基因组DNA的检测编辑本段回目录

  上述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后,均需检测DNA的产量和质量。
  1. DNA溶液稀释20-30倍后,测定OD260 /OD280 比值, 明确DNA的含量和质量。
  2. 取2-5μl 在0.7% agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。
  3. 取2μg DNA, 用10单位(U)HindⅢ酶切过夜, 0.7% agarose胶上电泳, 检测能否完全酶解(做RFLP, DNA必须完全酶解)。
  如果DNA中所含杂质多, 不能完全酶切, 或小分子DNA多, 影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理:
  (1)选用幼嫩植物组织,可减少淀粉类的含量。
  (2) 酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。
  (3)Sepharose柱过滤, 去除酚类、多糖和小分子DNA。
  (4)CsCl梯度离心, 去除杂质, 分离大片段DNA(可用作文库构建)。

组织DNA的提取和纯化编辑本段回目录

[原理] 本法用含EDTA的溶液洗涤细胞,SDS(十二烷基硫酸钠)破碎、裂解细胞,消化蛋白质,使核蛋白解聚并使细胞内的DNA酶失活,用酚、氯仿变性蛋白质并去除杂质,最后用乙醇沉淀得到纯化的DNA。
[试剂]裂解缓冲液
1、 苯酚-氯仿溶液
2、 氯仿-异戊醇溶液
3、 冰无水乙醇及70%乙醇
4、 TE缓冲液
5、 5mol/L NaCl
[操作]处死小白鼠一只,取新鲜肝脏,用生理盐水清洗去血水。
1、 每克组织加10ml裂解液制成匀浆。
2、 取2ml匀浆于离心管中,加等体积苯酚-氯仿溶液,加盖,缓缓来回颠倒5min,               
离心2500rpm×10min。
3、 取上层水相,加等体积氯仿-异戊醇溶液,加盖,缓缓来回颠倒5min,离心
2500rpm×10min。
4、 取上层水相至玻璃管内,加5mol/L NaCl至终浓度为0.3mol/L(2ml+100ul,3ml+150ul)。
5、 加2.5倍体积的冰无水乙醇,加盖,缓慢摇匀,见白色絮状沉淀DNA出现。
6、 用玻棒捞起DNA沉淀置于试管中,用1mLTE溶解。
7、 定量
       吸取DNA溶液100ul+2.9mlTE(30倍稀释),在260nm和280nm下读
   取吸光度值,
8、 计算
       DNA浓度(ug/ml)=A260nm×50×1/光径×稀释倍数

石蜡包埋组织的DNA提取及其应用编辑本段回目录

  一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法
  从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤,是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而来。Goelz等(1985)最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术,是用机械的方法破碎组织,切除多余的石蜡,直接进入含SDS和高浓度蛋白酶K(1mg/ml)的提取缓冲液加温孵育,然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整,但可被限制性内切酶切割,因而适于点杂交,印迹杂交等多种分子生物学实验。Dubeau等(1986)在上述方法上作了改进。首先通过组织切片用二甲苯脱蜡,保证了组织的完全破碎,使细胞与消化液充分接触,使DNA释放和蛋白去除更加完全;其次通过两步消化的方法,将不适于做分子杂交的降解的DNA小片段去除,仅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子,从而提高了DNA质量,适于做Southern印迹杂交分析。Moerkerk等(1990)对上述两种方法进行了比较,发现两种方法所取得DNA之点杂交结果一致,非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。
表  Gpelz氏DNA提取方法的主要步骤
1.切除多余石蜡,暴露组织
2.将组织切碎(最大径<0.5mm),称重;
3.溶于TE9提取液(组织<50mg/5ml,50~500mg/10ml),高速混悬2~3min;于48℃放置24h,其制备见表18-6;
4.再次混悬组织,加入蛋白酶K至终浓度1mg/ml,SDS至2%,孵育40h;
5.用等体积酚-氯仿溶液抽提3次;
6.2.5倍体积乙醇沉淀DNA
7.-70℃放置2~4h
8.9000×g离心1h
9.沉淀物用70%乙醇洗1次
10.干燥,TE(pH7.2)溶解。
表 TE9 DNA提取液的制备
500mmol/L Tris
20mmol/L EDTA
10mmoo/L NaCl
1% SDS
500μg/ml 蛋白酶K
  PH8.0
5μm组织切片

常规脱蜡、水化

第一次溶液A孵育(去上清)

第二次溶液A孵育(留上清)

氯仿-异戊醇抽提

RNA酶和蛋白酶消化

酚抽提

沉淀

(却除未螺旋化DNA)

透析
图 石蜡包埋组织DNA提取流程(Drbeau等,1986)

溶液A
2×SSC
100μg 蛋白酶K/ml
1% SDS
  不同类型的基因分析所要求的DNA质量长数量不同。Southern印迹杂交分析需要10~15μg大片段DNA(>20kb),因为杂交前要进行相应的限制性内切酶消化和凝胶分离不同片段长度的DNA。故DNA提取要求高,小片段DNA存在会直接影响杂交信号。与之相反,多聚酶链反应(PCR)则可在相对粗制的小片段DNA样本上进行,分析所需的DNA很少,0.5μg甚至更少即可。PCR的模板DNA制备方法很多,除上述两种方法外,还有更简便的直接水煮法(Sle-bos,et al, 1990;Smit, et al. 1988)、蛋白酶消化法(Impraim et al. 1987;Brice, et al. 1989)。这些方法不经过酚-氯仿-异戊醇抽提、DNA纯化等步骤,直接将组织放在去离子水中煮沸10min或在蛋白酶K缓冲液中消化4h,DNA即可释放出来。此提取物可直接用作模板,进行PCR扩增,但是,我们发现直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA,扩增率较低,且重复性不好。这可能是由于DNA附着的蛋白质去除不净而影响DNA变性和引物的结合,亦可能是由于标本中残留的固定剂等成分对Taq DNA多聚酶的抑制所致。
  二、影响DNA提取质量的因素
  1.固定剂对DNA的影响固定剂的类型直接影响提取DNA的质量。目前大多数实验室常用的中性缓冲福尔马林固定的标本,DNA保存完好,可以获得高分子量DNA。Warford等(1988)对甲醛固定过程中DNA变化进行了观察,发现核酸对甲醛反应性可分为两个阶段:①早期出现碱基快速可逆性羟甲基化;②数天后碱基对间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。DNA提取过程中的蛋白酶K消化,酚/氯仿抽提和纯化等步骤,可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性质改变。
  bramwell等(1988)发现,甲醛和戊二醛固定可使得DNA产量降低,醋酸甲醇(MAA)可导致DNA明显降解。Michel’s运输保存液或PBS存放组织虽提取DNA纯度高,但产量明显降低。Dubeau等也观察到含苦味酸(Bouin氏液)和含氯化汞的固定液(Zenker,Bs)处理标本不能获得完整的DNA。
  乙醇被认为是保存核酸的最佳固定剂。Wu等(1990)用无水乙醇固定标本48h,最长达2年,均可得到中量的高分子DNA。每mm3乙醇固定标本平均DNA产量为26.6μg,高于新鲜标本(19.4μg/mm3)。经限制性内切酶消化后,乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特征性卫星带,说明DNA被完成消化。Southern印迹杂交结果与冰冻组织一致。
  Sato 等(1990)用AMex方法处理组织,既可保存许多抗原成分,亦可使大分子量DNA完好无损。其基本方法为:将组织放至4℃丙酮浸透,移至-20℃过夜。然而再用丙酮分别在4℃和室温脱水各15min,苯甲酸透明两次,每次15min,最后60℃真空浸蜡2~3h,石蜡包埋。结果显示,每10mg AMex法处理的湿重组织提高分子量DNA71.4±14.53μg,与新鲜组织产量相当(70.4±13.76μg)。酶切、电泳和杂交反应亦相同于新鲜组织。提示AMex法是一种多用途组织处理技术,可以克服由于DNA降解、高分子量DNA减少和内切酶不完全消化所产生的电泳类型改变,是一种理想的DNA保存方法,特别适用于对形态学、免疫表型和基因改变的相关性分析。
  2.固定时间对DNA的影响固定过程中所发生的组织反应至今尚未被完全更理解,虽然理论上讲室温下福尔马林与DNA几乎不发生反应,但已发现碱基与组蛋白之间的甲基交联。这种福尔马林介导的甲基化直接影响DNA提取的效率。如果事实果真如此,那么固定的时间是一个重要的变异因素。然而,Goelz等没有发现固定时间对DNA提取质量的明显影响。Dubeau等认为组织固定时间太短或太长均会导致DNA的降解。该作者对固定12h到5天不同时间间隔标本的DNA提取显示,随着固定时间的延长,可螺旋化(Spoolable)的高分子量DNA明显减少。固定5天后可螺旋化DNA提取率仅有8%。Warford等也发现单细胞悬液经30min福尔马林固定后,DNA产量减少到30%,由此可见,不同标本对不同固定剂所需的最佳固定时间应摸索选定。根据Dubeau等经验,常规组织固定应在12h以上至110之内。
  3.固定温度等其他因素对DNA的影响核酸与固定剂的反应由反应成分、浓度、酸硷度以及温度等因素的调节 ,其中温度效应显得特别重要。室温下DNA双股螺旋链表现为两条由氢键连接在互补多聚核苷酸;加热到65℃时,氢键开始断裂;约90℃时,产生两条单链分子。在此变性状态下,甲醛与酸反应很快,通过羟甲基化作用可抑制DNA冷却后的再复性。
  最近,Koshiba等发现福尔马林固定过程中的DNA降解,是由于固定温度高,pH低以及甲酸的存在所致。通过应用缓冲福尔马林和低温下固定(4℃),可以明显改善DNA保存。
  酸性环境中DNA的降解已有过深入的研究。一般认为,强酸可导致DNA的完全解聚,而弱酸也能引起一些结构的改变。当pH达到2.5以下时,几乎所有的碱基之间氢键解离,使DNA双链断裂而产生不可逆的变性;随后出现N-糖苷键水解,使嘌呤残基游离;最后,多聚核苷之磷酯键缓慢水解,仅残留具有完整嘧啶的多聚脱氧核糖短臂。上述改变亦受温度或离子强度的影响。加入盐或降低温度可稳定氢键,因而可防止酸性条件下的DNA变性。然而,即使福尔马林被氢氧化钠中和,在室温下DNA亦发生降解,提示福尔马林本身即可降解DNA。福尔马林中DNA降解的机理及其预防有待于进一步研究。
  4.组织处理过程对DNA的影响我们发现,从常规组织处理的蜡块中提取的DNA,其大部分分子量在100bp~1000bp之间,主要分布于100~1500bp,仅约1/3的组织所提取DNA>20kb。这除与固定剂、固定时间等因素有关外,可能的原因还有:①组织从外科切除到固定之间的时间长短不一。当组织未固定或固定不充分时,核酸酶可自由作用;②不同肿瘤中核酸酶的水平不一,其在固定前或固定后均不发挥作用;③蜡块贮存的时间长短不一。虽然从不同贮存时间的蜡块中提取的DNA大小无绝对区别,但新近的蜡块比贮存10年以上的标本所获得的DNA分子量大。可能蜡块中仍存在导致DNA降解的因素。
  组织的浸蜡和包埋温度过高或时间过长,均可导致DNA变性,而产生单链DNA片段。单链DNA不能被限制性内切酶所消化,可导致电泳时泳动速率变慢。
  三、提高DNA提取质量的方法
  1.蜡块的选择从福尔马林固定的组织标本中未能提出完整的高分子量DNA的重要原因之一,是应用了固定不充分的组织。因此,在DNA提取前应检查组织切片。如果有自溶、退变或组织结构不清,大片出血等改变的蜡块不能用;若有明显坏死存在的蜡块,最好不用或将坏死部分切去后再用。尽可能地选用新近标本,缓冲福尔马林、丙酮和乙醇固定者最佳。
  2.DNA提取方法学的改善为了提高石蜡包埋组织DNA提取的质量和效益,人们从不同方面进行了探索。其中在DNA提取液的改良,蛋白酶的消化时间和DNA纯化等问题上取得了进展。①DNA提取液主要含SDS和蛋白酶K的TE缓冲液。固定和包埋组织由于化学修饰作用,使得DAN与蛋白质不易分离。因此,必须增加SDS和蛋白酶K的浓度和作用时间:SDS可增至1%~2%,蛋白酶K200~500μg/ml,最高可达1mg/ml;作用时间一般为2~4天,最长可达7天。蛋白酶K可分次加入,并注意不时震摇,使酶与组织充分接触。Koshiba等发现,利用Goelz等和Dubeau等提出的DNA提取方法,不能够得到令人满意的完整DNA。尿素和胍(guanidine)是DNA自然和人工交联最有力的剥脱剂,2-巯基乙醇可干扰二硫键,促进蛋白变性。作者对DNA提取液进行了改良,加入高浓度(4mol/L)尿素和2-巯基乙醇。应用此缓冲液,有效地从包埋组织中获得高质量DNA。②DNA释放率对于不同的组织类型是有差异的,取决于组织细胞密度和细胞外间质的多少。对于细胞丰富、含有很少间质的组织(例如脾脏),通过24h孵育80%以上DNA可释放出来;相同量的DNA释放对于富含致密间质的子宫肌瘤则需要6天时间;转移性畸胎瘤含中等细胞密度和疏松的间质,DNA释放率亦为中等。由此可见,对不同类型的组织DNA提取,蛋白酶K的孵育时间可作适当调整,以求最大量地获取大分子DNA。此外,对于Dubeau等提出的DNA提取过程中分次消化步骤的必要性,也有人提出异议。因为低、中分子量的核酸存在对限制性内切酶的消化和杂交不起作用。③Dubeau等发现,不适于进行酶切反应和杂交研究的化学修饰的DNA,可通过搅起完整的DNA而被动除去,因而强调了螺旋化(spooling)在DNA纯化中的重要性。该作者还发现延长组织固定时间的影响之一就是减少了可螺旋化DNA的量,杂交分析显示,螺旋化DNA杂交信号强,而未螺旋化DNA信号减弱。因此,增加DNA螺旋化可提高提取DNA质量和杂交效率。但是,Moerkert 等认为未螺旋化DNA不影响进行点杂交分析。
  3.避免DNA机械性损伤福尔马林固定和石蜡包埋使组织变得坚韧,很难达到匀浆的效果。经常的做法是将组织切成3~5μm薄片,使每一细胞都被切开。但是,我们认为切片太薄,容易过多地将DNA切断,影响高分子量DNA的获得率。最好是采用15~20μm的厚切片。高浓度蛋白酶K消化2~4天,使能达到细胞充分破碎、蛋白充分消化的目的。并尽可能避免机械性匀浆过程造成的DNA剪切。
  此外,在NDA释放出来以后的提取过程中,应尽可能轻柔操作,避免过多地移管。若必需移管时应选用大口吸管。尽可能避免人为的DNA剪切。纯化DNA用TE(pH8.0)溶解放4℃保存即可,若短期不用时应-20℃冻存,但切忌反复冻融,以免DNA降解。
  四、石蜡包埋组织DNA分析的方法学
  由于DNA提取方法的改善和DNA质量的提高,几乎所有基因分析的技术均可用于石蜡包埋组织,但目前分子病理学研究的常用方法是点杂交、Southern印迹杂交和多聚酶链反应(PCR)。
  1.点杂交  鉴于包埋组织DNA有一定程度的降解,因而点杂交被认为是一种简便、快速和实用的方法,特别适用于较大样本的筛选。Dyall – smith等(1988)采用未经抽提的蛋白酶消化产物直接点膜,进行点杂交分析,在3周内对200多病例进行筛选,对阳性病例和很难解释的弱阳性斑点,再进行原位杂交等方法作进一步证实。
  2.Southern印迹杂交Southern印迹杂交是经典的基因分析技术,已被广泛地用于基因突变,扩增、重排和丢失等许多方面的研究。石蜡包埋组织的Southern印迹杂交分析有以下几个方面值得注意:
  (1)当所分析的酶切片段长为300~500bp时,包埋组织DNA杂交信号强度只有相同量标准DNA的10%~85%。信号强度与原始DNA大小呈正相关,最小片段DNA产生最弱的信号。
  (2)包埋组织DNA所致的非特异性背景杂交比标准DNA为明显。这种背景杂交的产生可能是由于不包含到分析基因中两个限制性内切酶识别位点的小片段DNA存在。
  (3)由于背景杂交明显使得信号模糊,信/噪比缩小。根据Goelz的经验,约有25%石蜡包埋组织不适于作Southern印迹杂交。
  (4)某些限制性酶切片段的电泳速度比标准DNA稍迟缓。可能的原因是DNA直接或间接的化学改变使某些限制性酶切位点失活和/或单链DNA存在。
  (5)由于小片段DNA的存在,故用作杂交分析的DNA量应适当增加,以增强杂交信号。
  3.PCR分析PCR技术是近年来分子生物学技术的典范,已被广泛地用于分子病理学的各个领域。此技术不但特异性好和敏感性高,而且简便、快速、模板DNA要求不高,特别适于石蜡包埋DNA的分析。
  用于PCR扩增的DNA提取比较简单,既使少量DNA样品亦能产生大量特异性DNA拷贝。已被成功地用于各代木乃伊DNA的分析,小至1mm2的HE染色切片提取的DNA亦可获得满意的扩增,并可用于诊断。但是,为了提高PCR的敏感性和可重复性,模板DNA应尽可能地纯化,除去提取物中某些抑制PCR反应的成份。
  此外,切片过程中要注意防止污染,以免出现假阳性。
  最近,Davis等(1993)对PCR产物进行单链构型多态性(SSCP)分析,可以提高PCR敏感性5倍以上。SSCP分析是应用单链DNA在非变性聚丙酰胺凝胶上电泳,根据序列的不同所产生的构型差异来分析PCr 产物。此分析能检测出小到一个碱基的差异,因而可被广泛地用于研究点突变和基因多态性。
  此外,在包埋组织的DNA提取中往往发现有RNA的存在。这些未加任何保护而免受降解的RNA,不可能是完整的序列。然而,此发现提示用福尔马林固定的组织亦可作为Northern印迹杂交分析的可能材料来源。
  五、分子病理学研究中的应用
  1.基因重排分析与淋巴瘤的诊断分子生物学技术在肿瘤诊断中的应用,目前仅限于淋巴瘤/白血病。淋巴瘤以具有特异性抗原受体基因重排的单一性细胞增殖为特征。因此,克隆性免疫球蛋白(Ig)和T-细胞受体(TCR)基因重排的检出可作为淋巴瘤诊断的重要指标,这在国外许多实验室已成为常规诊断技术。
  Southern印迹杂交和PCR都已被成功地用于基因重排分析。此技术在下列病变的诊断和鉴别诊断中特别有意义:①恶性淋巴瘤与反应性淋巴组织增生的鉴别。后者为多克隆性细胞增生,不能检出或扩增出克隆性基因重排序列;②T和B细胞性肿瘤的区分:PCRβ基因重排支持T细胞源性,而Ig重链基因则为B细胞源性。然而,一部分病例显示Ig和TCR基因双重排。在这种情况下,要结合其他基因分析。若同时伴有Ig轻链(K或人)基因重排则支持B细胞肿瘤;同时伴有TCRr或TCRs基因重排则为T细胞肿瘤。另外,也可结合免疫分型。双基因重排的肿瘤往往一种基因为不完全重排、不伴有相应的抗原受体表达,故免疫表型上往往是单一的。③T细胞性淋巴瘤的诊断,T细胞肿瘤形态变化多端、免疫表型上无克隆性标记,故对此类淋巴瘤均有必要进行基因分型。④T细胞优势性B细胞淋巴瘤。这种肿瘤在形态和免疫表型上很难建立诊断。⑤残留病变监测和复发的早期诊断。此技术还可用于识别骨髓的累及、治疗或骨髓移植后残余病变的检测,以及形态学上不能察觉的早期复发的诊断。</P< p>
某些淋巴瘤/白血病所伴有的特异性染色体易位是另一种类型的基因重排标记。例如滤泡型淋巴瘤中常出现的t(14:18)易位,Burkitt氏淋巴瘤的t(8:14)、t(8:2)和t(8:22)易位,以及慢粒或急淋白血病中常见的t(9:33)易位。因上述基因重排在淋巴瘤中出现频率不高,故诊断应用价值不大。
  2.癌基因与抗癌基因的研究分子生物学在肿瘤病理学中另一热点是癌基因和抗癌基因的研究。自从1981年Weinberg 等首先报道人癌基因分离成功以来,至今已有50多种癌基因被发现,这些基因普遍存在于各种生物细胞中,对于细胞的生长和分化起着重要作用。在正常情况下,其表达受到严格调控;病理状态下,癌基因活化,表达失控,使细胞原有的正常生物学性状发生改变,从而导致细胞癌变。据报道,癌基因的结构和功能改变见于造血系统、乳腺、粘膜鳞状上皮、前列腺、肺、肾、消化道、膀胱、卵巢、消化腺、神经系统和软组织等肿瘤。
  另一类基因称抗癌基因或抑癌基因,现已发现的有p53、Rb、DCC、WT1和NF1等。其蛋白产物的功能是阻滞癌基因所编码多肽的活性。因此,如果抗癌基因发生突变或功能丧失,异常的癌基因产物表达失控,而诱发细胞转化为肿瘤。此现象为见于视网膜母细胞瘤、子宫内膜、结肠、食管等各部位的肿瘤。
  目前,对人类肿瘤中癌基因和抗癌基因的检测,已经在肿瘤的分类、发病机理、肿瘤生物学行为和预后的关系等方面与肿瘤临床密切结合起来,并正在逐渐地应用于肿瘤的诊断、鉴别诊断和治疗。
  (1)癌变机理的研究:癌基因活化和抗癌基因失活在人类肿瘤的发生发展过程中起重要作用。已有大量证据表明,至少需要两种以上的癌基因活化的协同作用才能使正常细胞发生恶性转化。目前研究发现绝大多数肿瘤有一种以上的癌基因过度表达,一种癌基因对靶细胞的永生化起重要作用,而另一种则促进细胞的永生化。
  (2)肿瘤生物学待业和预后的研究:某些癌基因突变及其产物的过度表达与癌细胞的分化和恶性程度有关。目前研究最多的是c –erbB –2与乳腺癌的关系。许良中等(1992)发现,浸润性导管癌中c – erbB –2阳性表达率达67%以上,单纯癌阳性率为26.5%,而全部乳癌良性病变皆阴性。我们的研究发现,c –erbB –2 过度表达的乳腺癌预后不良,Schimmelpenning等(1992)也报告伴有c –erbB –2 扩增的导管内癌易于发生周围浸润。此外,ras P21在乳腺癌中的表达也有上述趋势。
  (3)辅助诊断和鉴别诊断:bc1-2基因已被用于滤泡型淋巴瘤与反应性滤泡增生的鉴别诊断,前者阳性表达率在80%以上,而后者几乎为阴性;ras癌基因突变或过度表达有助于甲状腺乳头状癌、乳腺导管癌、结肠腺癌等肿瘤的诊断;小细胞肺癌常伴有n –myc突变。
  (4)癌细胞的组织发生:paget 氏病可分乳腺外(EPD)和乳腺内(MPD)两种。有关paget细胞的起源问题仍有争议。许良中(1993)观察了c –erbB –2和p53在77例EPD和10例MPD中的表达,认为MPD中的paget细胞是来源于腺癌细胞而不是表皮的角质层细胞。EPP中的paget细胞也来源于腺癌细胞,但这种腺癌细胞与MPD中的腺癌细胞不同,因为两者基因表达不同。
  3.遗传病的基因诊断遗传病的回顾性家族调查,可通过石蜡包埋组织完成。Mueller等描述1例怀疑囊性纤维化(CF)的死婴,石蜡包埋组织是唯一的材料来源。应用CF基因标记引物,对患儿和其父母的DNA分别进行PCR扩增。扩增产物用相应内切酶消化并检测限制性片段多态性。结果显示父母和患儿在同一位点上有意义,表明患儿遗传有突变型CF基因,最后证实了CF的诊断。
  另一种常见的遗传病–肌营养不良症(DMD),是由Dystrophin基因的DNA序列畸变引起。Forstboefel等用该基因的已知编码DNA序列,从一死婴尸检组织中得到的DNA进行选择性PCR扩增。结果发现DMD基因的一关键部分缺失,进而证实了DMD的诊断。同样可通过亲代DNA分析,区分遗传性或散发性缺失。
  4.病理微生物的检测核酸杂交和PCR技术对病原微生物的检测亦具有独到之处,除其特异性和敏感性极高外,还可适用于石蜡切片等多种材料,且可避免因培养造成的病原扩散。特别是一些原位杂交和PCR诊断性试剂盒的问世,使此项检测更加简便易行。因此,分子生物学将是传染病实验室诊断技术的发展方向。这方面的应用已有很多报道,本节 不再赘述。
  5.组织来源的鉴定PCR可用于选择性扩增一部分HLa –DQa 基因,这部分是人类基因组中高度多肽性的位点。DNA序列微小的个体差异,可被特异性cDNA探针区分。此基因在人群中的正常变异是有图谱的,故可将其用作“基因指纹”来验证组织来源。在日常工作中偶尔遇到标本的标记错误,当观察组织切片,发现与临床资料不匹配时才被发现。Shibata等通过分析石蜡标本DNA中HLa –DQa位点解决了这一难题。另一高度多肽性的基因-低密度脂蛋白受体基因,亦可同样用于标本的鉴定。
  Dubeau等发现提取DNA的甲基化类型是恒定的,包埋组织仍保留其原有的特异性甲基化特征,籍此可有助于识别某些肿瘤的起源组织。
  综上所述,石蜡包埋组织DNA的提取扩展了分子生物学技术在临床上的应用范围。虽然现在回顾性DNA分析仅用于确定少数特异性诊断,但随着越来越多的感染性病原基因、特异性肿瘤基因和遗传病基因的识别和克隆,相信不远的将来基因诊断的应用范围会进一步拓宽,分子杂交等基因分析技术将会在病理学诊断和研究中发挥越来越重要的作用。

外周血DNA提取技术编辑本段回目录

分离外周血白细胞提取方法:

试验步骤:

1、取人肘静脉血5ml,EDTA抗凝,2500rpm离心10min。

2、小心吸取上层血浆,分装到3个0.5ml离心管中。

3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液,摇匀,冰浴15min。

4、2500rpm离心10min,弃上清。

5、加入10ml溶血液,摇匀,冰浴15min。

6、3000rpm离心10min,弃上清。

7、倒置离心管,去掉残液。

8、得白细胞,-80?C冻存。

试验要求:

血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h,4℃放置不超过5h,以防白细胞自溶。


氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA:

试验试剂:

Ligsisbuffer:

133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml;最后加灭菌去离子水至1000ml,高压灭菌。

ACD抗凝剂:柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g;最后加灭菌去离子水至350ml,高压灭菌。

提取缓冲液(Extractionbuffer):

10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml;最后加灭菌去离子水至100ml,高压灭菌

试验步骤:

1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl,充分颠混至清亮。以4000rpm,离心5min。弃上清液。

2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl,充分匀浆。以6000rpm,离心5min。

3、彻底弃去上清,加入extractionbuffer500μl(裂解细胞),混匀置于37℃,水溶1h。

4、加入8μl的蛋白酶K,颠混,37℃过夜(或55℃,3h,但是37℃效果要好些)。

5、每管加入450μl饱和酚(取溶液下层)缓慢摇晃10min,以5500rpm,离心15min。

6、取上清,每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿-异戊醇,摇匀10min,以5500rpm,离心15min。

7、取上清,每管加入500μl氯仿-异戊醇,摇匀10min,以5500rpm,离心15min。

8、取上清,每管加50μl的3M的NaAC+,适量无水乙醇(预冷)至满,摇匀放入-20℃保存2h以上。

9、以12000rpm,离心20min。去上清,加入70%乙醇500μl,以12000rpm,离心5min,去上清,50-60℃干燥。

10、加入50μl灭菌去离子水,转弹,混匀。


NaI提取法提取外周血白细胞基因组:

实验步骤:

1、取外周抗凝血(全血)100ul于eppendorf管中,12000rpm离心12min。

2、弃上清,加双蒸水200ul溶解,摇匀20s。

3、混匀后加6MNaI溶液200ul,摇匀20s。

4、加入氯仿/异戊醇(24:1)400ul,边加边摇,摇匀20s,12000rpm离心12min。

5、取上层液350ul,加入另一新eppendorf管中,加0.6倍体积异丙醇,摇匀20s,室温放置15min,静置后的反应体系15000rpm离心12min,使沉淀紧贴eppendorf管壁。

6、弃异丙醇,加70%乙醇1ml(不振动),以15000rpm离心12min。

7、弃乙醇,敞开eppendorf管盖,烘干(37℃恒温箱)后,加1xTE溶液30ul,溶解DNA>12h以上,制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。


常用的外周血白细胞基因提取方法:

试验原理:

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂,反复抽提,使蛋白质变性,SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解,在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子,核蛋白变性降解,使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水,不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团,也容易进行水合作用,并在表面形成一层水化层,使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时,蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏,变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相),DNA存在于上层水相中,蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA,回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐,真空干燥,用TE缓冲液溶解DNA备用。

试验步骤:

1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中,加入1ml磷酸缓冲盐溶液(PBS),混匀,3500rpm离心15min倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀,37℃水浴温育1h。

2、将上述DNA提取液混悬白细胞,37℃水浴温育1h后,加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml至终浓度为100-200ug/ml上下转动混匀,液体变粘稠。50℃水浴保温3h,裂解细胞,消化蛋白。保温过程中,应不时上下转动几次,混匀反应液。

3、反应液冷却至室温后,加入等体积的饱和酚溶液,温和地上下转动离心管5-10min,直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min,用大口吸管小心吸取上层粘稠水相,移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿﹕异戊醇(24﹕1),上下转动混匀,5000rpm离心15min,用大口吸管小心吸取上层粘稠水相,移至另一离心管中。重复一次。

4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇,室温下慢慢摇动离心管,即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA,转入另一1.5ml离心管中,加70%乙醇0.2ml,以5000rpm离心5min。洗涤DNA,弃上清,去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇,但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA置于摇床平台缓慢摇动,DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

真核细胞DNA的制备编辑本段回目录

一般真核细胞基因组DNA有107-9bp,可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取,常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析,还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

根据材料来源不同,采取不同的材料处理方法,而后的DNA提取方法大体类似,但都应考虑以下两个原则:

1、防止和抑制DNase对DNA的降解。

2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

试剂准备:

1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。

3、裂解缓冲液:250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4、20%SDS

5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris饱和酚(pH8.0)、酚/氯仿(酚∶氯仿=1∶1)、氯仿

7、无水乙醇、75%乙醇

试验步骤:

材料处理:

1、新鲜或冰冻组织处理:

1)取组织块0.3-0.5cm3剪碎,加TE0.5ml,转移到匀浆器中匀浆。

2)将匀浆液转移到1.5ml离心管中。

3)加20%SDS25ml,蛋白酶K(2mg/ml)25ml,混匀。

4)60 C水浴1-3hr。

2、培养细胞处理:

1)将培养细胞悬浮后,用TBS洗涤一次。

2)离心4000g 5min,去除上清液。

3)加10倍体积的裂解缓冲液。

4)50-55 C水浴1-2hr。

DNA提取:

1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中,温和、充分混匀3min。

2、离心5000g 10min,取上层水相到另一1.5ml离心管中。

3、加等体积饱和酚,混匀,离心5000g 10min,取上层水相到另一管中。

4、加等体积酚/氯仿,轻轻混匀,离心5000g 10min,取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清,可重复此步骤数次。

5、加等体积氯仿,轻轻混匀,离心5000g 10min,取上层水相到另一管中。

6、加1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇,轻轻倒置混匀。

7、待絮状物出现后,离心5000g 5min,弃上清液。

8、沉淀用75%乙醇洗涤,离心5000g 3min,弃上清液。

9、室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。

植物组织中DNA的提取编辑本段回目录

试验原理:

脱氧核糖核酸(deoxribonucleicacid,DNA)是一切生物细胞的重要组成成分,主要存在于细胞核中,盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA,其中还含有大量RNA,即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中,而RNA则能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中,利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中,细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中,使DNA因被降解而影响得率,在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA,既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离,再加入阴离子去垢剂0.15%的SDS,经过2h搅拌,或用氯仿-异醇除去蛋白,通过离心使蛋白质沉淀而除去,得到的是含有核酸的上清液。然后用95%的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。

植物DNA的SDS提取法:

试验试剂:

1、研磨缓冲液:称取59.63gNaCl,13.25g柠檬酸三钠,37.2gEDTA-Na分别溶解后合并为一,用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0,并定容至1000ml。

2、10 SSC溶液:称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠,分别溶解,一起定容至1000ml。

3、1 SSC溶液:用10 SSC溶液稀释10倍。

4、0.1 SSC溶液:用1 SSC溶液稀释10倍。

5、Rnase溶液:用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液,用1mol/LHCl,pH至5.0,使用前经80℃水浴处理5min(以破坏可能存在的Dnase)。

6、氯仿-异戊醇:按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。

7、5mol/L高氯酸钠溶液:称取NaClO4.H2O70.23g,先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。

8、SDS(十二烷基硫酸钠)化学试剂的重结晶:将SDS放入无水酒精中达到饱和为止,然后在70~80℃的水浴中溶解,趁热过滤,冷却之后即将滤液放入冰箱,待结晶出现再置室温下凉干待用。

9、1mol/LHCl。

10、0.2mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛试剂:1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中,添加1.5ml浓硫酸,装入棕色瓶,贮存暗处,使用时加0.1ml乙醛液[浓乙醛:H2O=1:50(V/V)]。

12、1.0mol/L高酸溶液(HClO4)。

13、0.05mol/LNaOH。

14、DNA标准液:取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中,再用0.05mol/LNaOH定容至25ml,后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中,加5.0ml1mol/LHClO4,混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度,则得100μg/ml的标准溶液。

实验步骤:

1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中,加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS,置冰浴上研磨成糊状。

2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液,加上塞子,剧烈振荡30s,转入离心管,静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。

3、离心形成三层,小心地吸取上层清液至刻度试管中,弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4、将试管置72℃水浴中保温3min(不超过4min),以灭活组织的DNA酶,然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温,加5mol/L高氯酸钠溶液[提取液:高氯酸钠溶液=4:1(V/V)],使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。

5、再次加入等体积氯仿-异戊醇混合液至大试管中,振荡1min,静置后在室温下离心(4000rpm)5min,取上清液置小烧杯中。

6、用滴管吸95%的预冷乙醇,慢慢地加入烧杯中上清液的表面上,直至乙醇的体积为上清液的两倍,用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

7、然后加入0.5ml左右的10 SSC,使最终浓度为1 SSC。

8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9、加入已处理的Rnase溶液,使其最后的作用浓度为50~70μg/ml,并在37℃水浴中保温30min,以除去RNA。

10、加入等体积的氯仿-异戊醇混合液,在三角瓶中振荡1min,再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白,室温下以4000rpm离心5min,收集上层水溶液。

11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。

植物DNA的CTAB提取法:

试验步骤:

1、称取新鲜叶片2-3g,剪碎放入研钵中,在液氮中研磨成粉末。

2、将粉末转移到加有7ml经预热的15 CTAB提取缓冲液15ml离心管中,迅速混匀后置于65℃水浴中,温育30min。

3、取出离心管冷却至室温,加入氯仿/异戊醇(24:1),充分混匀,室温下2300转离心20min。

4、将上清转移至另一新的15ml离心管中,加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀,2300rpm离心20min。

5、转移上清至另一新的15ml离心管中,加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液,轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min,使DNA沉淀于管底。

6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中过夜。

7、待DNA完全溶解后,加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀,挑出DNA,置于15ml离心管中,用70%乙醇清洗30min。

8、离心机甩5s,倒出70%乙醇,再用95%乙醇浸泡5min,倒出95%乙醇,在超净工作台上吹干。

9、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存。

细菌DNA的提取方法编辑本段回目录

针对一些不易于提取的细菌的方法:

试验试剂:

抽提缓冲液:2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)(去色素)100mMTris-HCl(pH8.0)

25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl

10MLiCl

2MLiCl

DEPC-water(抑制RNA酶活性)

3MNaAc(pH5.2)

96%乙醇

70%乙醇

试验步骤:

1、抽提缓冲液65℃预热。

2、加菌体到已经预热的缓冲液(700ul)中混匀,65℃,10min。

3、加酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),振荡,以12000rpm,离心10min。

4、取上清,加氯仿/异戊醇(24:1)振荡,以12000rpm,离心10min。

5、重复再作一次步骤4。

6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇(或加入等体积的异丙醇),-20C下沉淀。

7、以2000rpm,离心10min。

8、弃上清,以70%乙醇条洗沉淀,也可以再用100%乙醇洗,然后溶解于100ml水中。


较为常用的细菌DNA提取方法:

实验步骤:

1、将菌株接种于液体LB培养基,37℃震荡培养过夜。

2、取1.5ml培养物12000rpm离心2min。

3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液,反复吹打使之重新悬浮,加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K,混匀,于37℃温育1h.

4、加入100ul5mol/LNaCl充分混匀,再加入80ulCTAB/NaCl溶液,混匀后再65℃温育10min。

5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀,离心4-5min将上清转入一只新管中,加入0.6-0.8倍体积的异丙醇,轻轻混合直到DNA沉淀下来,沉淀可稍加离心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后,离心弃乙醇.

真菌DNA提取总结的两种方法编辑本段回目录

第一种方法:

试验步骤:

1、取真菌菌丝0.5g在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液,快速振荡混匀。

3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋3~5min(此处是粗提没有加酚)。

4、以4℃,1000rpm,离心5min。

5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃,10000rpm,离心5min。

6、取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀混匀静置约30min。

7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀用75%乙醇反复漂洗数次再用无水乙醇漂洗1次吹干,重悬于500ulTE中。

8、加入1ulRNaseA(10mg/mL),37℃下处理1h。

9、用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃,10000rpm,离心5min。

10、取上清,加入1/10倍体积的3MNaAc2.5倍体积的无水乙醇-70℃沉淀30min以上。

11、沉淀用75%乙醇漂洗,风干溶于200ulTE中,-20℃保存备用。

DNA提取液:0.2MTris-HCl(pH7.5),0.5MNaCl,0.01MEDTA,1%SDS,3MNaAc。

第二种方法:

试验步骤:

1、真菌菌丝0.5-1g在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液,快速振荡混匀65℃水浴30min期间混匀2-3次。

3、加入1mL5MKAc,冰浴20min。

4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10000rpm,4℃离心5min)。

5、取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇混匀静置约30min。

6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀用75%乙醇反复漂洗数次再用无水乙醇漂洗1次吹干,重悬于500ulTE中。

7、加入1ulRNaseA(10mg/mL),37℃处理1h。

8、用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃,10000rpm,离心5min。

9、取上清,1/10V3MNaAc2.5V体积的无水乙醇-70℃沉淀30min以上。

10、沉淀用75%乙醇漂洗,风干溶于200ulTE中,-20℃保存备用。

组织mRNA提取操作步骤 编辑本段回目录

  (一)总RNA提取-Trizol法
  Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析,斑点杂交, Poly(A)+分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆。
  1、将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
  2、研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。
  3、取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。
  4、弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500g离心5分钟。
  5、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中,必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
  [注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。
  2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。

  (二)mRNA提取
  由于mRNA末端含有多poly(A)+,当总RNA流径oligo(dT)纤维素时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA可被洗下,经过两次oligo(dT) 纤维素柱,可得到较纯的mRNA。
  1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。
  2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床体积为0.5-1.0ml,用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。
  3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床,直到流出液的pH值小于8.0。
  4、将(一)中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温,加入等体积2x柱层析缓冲液,上样,立即用灭菌试管收集洗出液,当所有RNA溶液进入柱床后,加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。
  5、测定每一管的OD260,当洗出液中OD为0时,加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液,以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。
  6、测定OD260,合并含有RNA的洗脱组分。
  7、加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2), 2.5倍体积的冰冷乙醇, 混匀, -20℃30分钟。
  8、4℃下12000g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗 涤沉淀,4℃下12000g离心5分钟。
  9、小心弃去上清液,沉淀空气干燥10分钟,或真空干燥10分钟。
  10、用少量水溶解RNA液,即可用于cDNA合成(或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃)。
  [注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
  2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净,然后用层析柱加样缓冲液平衡,并加入0.02%叠氮钠(NaN3)冰箱保存,重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。

RNA酶活性的控制编辑本段回目录

  为了获得高质量的真核细胞mRNA, 必须使用RNA酶的抑制剂或采用下述的破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法,最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的RNA酶的活性。同时,避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量RNA酶也很重要。下面列举避免RNA酶法染问题的一些注意事项。大多数有经验的研究者并不拘泥于这些注意事项,只是在遇到问题时可能采用其中的一种或几种方法加以解决。
(一)实验程序
  如不谨慎操作,外源性RNA酶可以通过下述途径污染RNA制品:
(1)玻璃制品、塑料制品和电泳槽 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶,可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染,使用前必须于180 ℃干烤8小时或更长时间(玻璃器皿)或用氯仿冲洗(塑料制品)。另一种方法是用0.1 %焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂,但其作用并不是绝对的(Fedorcsak和Ehrenberg,1966)。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小时,然后用灭菌水淋洗数次, 并于100℃干烤15分钟(Kumar和Lindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的DEPC,以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。
  羧甲基化的RNA在无细胞体系中翻译效率很低,然而,除非其中大部分嘌呤碱基均被修饰,否则其形成DNA:RNA或RNA:RNA杂交休的能力并不明显降低。用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净,再用水冲洗,用乙醇干燥,然后灌满3%的H2O2溶液,于室温放置10分钟,然后用0.1 %DEPC(见下文)处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记,存放在指定地点,为RNA实验专用。
(2)研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此,在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时,主有涉及RNA的一切操作过程中,都应戴一次性手套,接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后,手套就可能沾染上RNA酶,因此进行RNA实验时应勤换手套。
(3)污染的溶液 用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1%DEPC于37℃至少处理12小时,然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。注:DEPC可与胺类迅速发生化学反应,因些不能用来处理含有Tris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。
(二)RNA酶的抑制剂
下面介绍3种广泛应用的特异性RNA酶抑制剂。
(1)RNA酶的蛋白质抑制剂是 从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种RNA酶紧密结合(KI≈3x1010)形成非共价结合的等摩尔复合物,使RNA酶失活。此蛋白质体内可能是血管生成素的抑制剂,血管生成素是氨基酸序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子, 几个厂家以不同的商品名出售这种抑制剂,该蛋白质应置于含5mmol/L二硫苏糖醇(DTT)的50%甘油中,贮存于-20℃。抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用,因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的RNA酶。因此,在使用变性剂裂解哺乳动物细胞这一提取RNA的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。然而职用更温和的裂解方法时应使用这种抑制剂,并且在后续的所有RNA纯化步骤中均应有此蛋白质存在。由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂,故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大活性的发挥要求巯基试剂,而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。
(2)氧钒核糖核苷复合物 这种由氧钒(IV)离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物,是量种过渡态类似物,它能与多种RNA酶结合并几科能百分之百地抑制RNA酶的活性。这4种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中,在RNA提取和纯化的所有过程中,其使用浓度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母细胞中进行翻译, 并能作为某些外酶促反应(如mRNA反转录)的模板。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译,因此必须用含0.1 %羟基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有几家公司出售氧钒核糖核苷复合物。
(3)Macaloid(硅藻上) Macaloid是一咱粘土,很多年前就发现它能吸附RNA酶,用缓冲液将其制成浆液,以0.015%(W/V)的终浓度溶解细胞。 这种粘土随同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中(如酚抽提后)经离心去除。
(三)破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法
  用强烈变性如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质, 导致细胞结构破碎,核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来。RNA酶可耐受多种处理等,因此可联用上述试剂,从组织中,如富含RNA酶的胰腺中,提取完整无损的RNA。下述实验程序系列利用RNA酶抑制剂和(或)能迅速灭活RNA酶的有关方法从组织或细胞培养物中分离总RNA、核内RNA和胞质内RNA。

用异硫氰酸胍和有机溶剂提取RNA编辑本段回目录

收集细胞,离心5000r/min ,5分钟,弃上清,加入异硫氰酸胍变性液(异硫氰酸胍4mol/L;柠檬酸钠25mmol/L,Sarkosy10.5%,β-巯基乙醇0.1mol/L)500l,混匀,振荡10秒,加2 mol/L醋酸钠50l,水饱和酚500 l和氯仿/异戊醇(49:1)100 l颠倒混合数秒钟,冰浴15分钟,4℃离心10,000 r/min,15分钟,吸取上清,加入等体积异丙醇或2倍体积无水乙醇,4℃离心10,000 r/min,10分钟,弃上清,70%酒精洗涤一次,抽干,加35lDEPC处理水溶解,取5l经稀释后紫外测定RNA提取量,其余30l分装,-20℃保存备用。

mRNA的分离编辑本段回目录

与rRNA和tRNA不同的是,哺乳动物细胞的绝大部分mRNA在其3'端均有一poly(A)尾,因此可以用oligo(dT)-纤维素亲和层析法从大量的细胞RNA中分离mRNAdmonds等,1971;At Leder,1972)。在构建cDNA文库时, 必须经上述纯化步骤制备mRNA模板。
进行Northern杂交或Sl 核酸酶作用图分析时,与总RNA相比,采用poly(A)+ RNA能获得更为满意的结果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制备Oligo(dT)-纤维素,也可以买现成的产品。
1)用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g 0ligo(dT)-纤维素。
2)将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱或装入填有经用DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴期德吸管中, 柱床体积为0.5-1.0ml,用3倍柱床体积灭菌水冲洗柱床。柱床体积为1m的oligo(dT)-纤维素最大量为10mg总RNA,如果总RNA的量较少,则应减少oligo(dT)-纤维素的使用量以防止poly(A)+RNA在过柱以及后续步骤中损失。
3)用无菌的1x层析柱加样缓冲液冲洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。1x层析柱加样缓冲液
20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)
0.5mol/L NaCl
1mmol/L EDTA(pH8.0)
0.1%SDS
可按以下方法制备灭菌的层析柱加样缓冲液;将适量无RNA酶的Tris. Cl(pH7.6)、氯化钠和EDTA贮存液混合在15lbf/in2(1.034x105Pa)高压下蒸气灭菌,待其次序却至65℃左右时加入已在65℃预热30分钟的10 %SDS贮存液。也可以用0.05mol/L柠檬酸钠代替Tris.Cl 然后用DEPC处理柠檬钠-NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。
4)用灭菌水溶解RNA,于65℃温育5分钟后使迅速冷却至室温,加等体积的2x层析柱加样缓冲液,上样,立即用灭菌的试管收集洗液。 当所的RNA溶液均进入柱床后,加1倍体积的1x层析柱加样 ,继续收集洗出液。加热RNA可以破坏可能涉及poly(A)尾的二级结构。
5)当全部溶液流出后,将收集液置于65℃温育5分钟,重新上样,并收集流出液。
6)用5-10倍柱床体积的1x层析柱加样缓冲液洗柱,分部收集洗出液,测定每一收集管的OD260。最补由于不带poly)A)的RNA洗过柱床, OD260会很高,后来OD260值则很小或为零。在某些方案中,上述步骤后还用5倍柱术体积的含0.1mol/L NaCl的1x 层析柱加样缓冲液洗柱床,然而由于洗出的不带poly(A)的RNA很少甚至没有, 因此这一步骤可以省略。
7)用2-3倍柱床体积的经灭菌且无RNA酶的洗脱缓冲液洗脱mRNA,以1/3-1/2柱床体积分部收集洗脱液。洗脱缓冲液
10mmol/L Tris.Cl(pH7.6)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
0.05%SDS
用于配制洗脱缓冲液的Tris. Cl 和EDTA贮存液应为新近高压的溶液 可用适量的灭菌水稀释上述贮存液配制洗脱缓冲液。洗脱缓冲液不能高压处理,因高压会使溶产生大量气泡。
8)收集液置于透明的小溶器内,测定OD260, 使用前比色杯须用浓盐酸:甲醇(1:1)浸泡1小时,再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗合并含有RNA的洗脱组分。经上述一轮oligo(dT)-纤维素亲和量层析后得到的RNA中,带与不带poly(A)的RNA,其含量近乎相等。如欲进一步纯化mRNA,可将洗脱液于65 ℃温育3分钟,迅速冷却至室温,加入NaCl至终浓度为0.5mol/L,用同一oligo(dT)纤维素柱进行第二轮层析。
9)收集oligo(dT)-纤维素柱层析的洗脱液,在mRNA溶液中加入3mol/L乙酸钠(pH5.2)至终深度为0.3mol/L并混匀。加2.5 倍体积用冰预冷的乙醇,混匀,冰浴至少30分钟。
10)于4℃以10 000g离心15分钟回收poly(A)+RNA,小心弃去上清液,用70 %乙醇洗涤沉淀(通常看不见沉淀),离心片刻,在空气中晾干核酸沉淀。
11)用少量水重溶RNA,置于比色杯内,测定OD260, 使用前比色杯须用浓盐酸:甲醇(1:1)浸泡1小时,再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗
12)将mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯离心管内,加3倍体积乙醇, 混匀,于-70℃保存备用。回收RNA时,只需取出一小份贮存液,加3mol/K乙酸钠(pH5.2)至终浓度为0.3mol/L, 混匀,用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟即可。
i.OD260=1的溶液其RNA含量约为40μg/ml.
ii.从107个哺乳动物培养细胞中可获得1-5μg mRNA,所得mRNA通常只占上柱的总RNA的1-2%。 

哺乳动物细胞总RNA的分离编辑本段回目录

  这一从培养的单层哺乳动物细胞中分离RNA的实验程序系为Favaloro 等(1980)所介绍程序的改良。该程序同样适用于从悬浮培养的哺乳动物细胞中或从易于分散成单个细胞的哺乳动物组织中分离RNA。但不适用于从固体组织中提取RNA,因为用这种裂解细胞的方法(在SDS存在的条件下用蛋白酶K消化)去消化组织速度很慢,导致内源性RNA酶在被蛋白酶K消化或被抑制剂灭活前有时间发挥作用。原方案中(Favaloro等。1980)采用的裂解缓冲液含有0.015 %(W/V)的Macaloid(硅藻土),用于吸附并灭活RNA酶。尽管现仍有Macaloid出售NL Chemicals), 但氧钒核糖核苷复合物和RNA酶的蛋白质抑制剂更常用。下述程序的优点是速度快,并能同时处理很多样品。
一、细胞的裂解
a.单层细胞的裂解
a)吸出培养液,以7ml用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲盐溶液PBS冲洗细胞培养皿内的单层细胞,重复1次,将平板置于冰上直至所有单层细胞冲洗完毕。也可将平板放在一块铝板上,再将铝板置于冰盘上。
b)直径为90mm的培养皿需加0.5ml RNA提取缓冲液, 并使之遍布整个平板的表面。
  RNA提取缓冲注液
    0.14mol/L NaCl
    1.5mmol/L MgCl2
    10mmol/L Tris.Cl(pH8.6)
    0.5%NP-40
    1mmol/L二硫苏糖醇(DTT)
100单位/ml胎盘RNA酶抑制剂或20mmol/L氧钒核糖核苷复合物
c)加0.5ml蛋白酶消化缓冲液,用刮棒混匀粘稠状裂解物并将其刮到平板的边缘。
  蛋白酶消化缓冲液
    0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0)
    25mmol/L EDTA(pH8.0)
    0.3mol/L NaCl
    2% SDS
d)用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物,再将其注入聚丙烯管内。重复3-4次,剪切DNA。
c)加蛋白酶K至终浓度为200μg/ml,充分混匀后置于37℃温育30分钟。
蛋白酶K以贮存液的形式保存,贮存液为20mg/ml 蛋白K溶液。
b.悬浮培养的细胞或组织单细胞悬液的裂解
a)于4℃以2000g离心5分钟收集细胞,以10倍体积用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲液悬沉淀,洗涤细胞3次,每次均用大口径的吸管轻轻吹打细胞沉淀,使其彻底分散。
b)估计细胞沉淀的体积,用10-20倍体积的RNA提取缓冲液重悬之。
c)加入与步骤b)所加RNA提取缓冲液体相同的蛋白酶消化缓冲液,用振荡器迅速混匀。用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物,再将其注入聚丙烯管内。重复3-4次,剪切DNA。
d)加蛋白酶K至终浓度为200μg/ml,充分混匀后置于37℃温育30分钟。蛋白酶K以贮存的形式保存,贮存液为20μg/ml蛋白酶K水溶液。
二、提取步骤

2)用等体积酚:氯仿抽提1次,以去除蛋白质。
3)用吊桶式转头于室温以5000g离心10分钟使水相与有机相分相, 将水相吸至一个新的离心管内,加2.5倍体积用冰预次序的乙醇,充分混匀, 于0℃放置1小时。
4)于0℃以5000g离心10分钟沉淀RNA,弃上清,用含0.1mol/L 乙酸钠(pH5.2)的70%乙酸洗涤沉淀,用自动微量移液器尽可能将乙醇吸尽, 随后于室温放置几分钟,晾干沉淀。切勿抽干沉淀,因为干的核酸沉淀很难溶解。
5)每个直径为90mm的培养皿或每107细胞加200μl 50mmol/L Tris.Cl( pH7.8)1mmol/L EDTA(pH8.0)溶液重溶沉淀。
6)分别按10mmol/L和0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫苏糖醇(DTT),然后分别按1000单位/或10mmol/L 的终深度加台盘RNA酶抑制剂或氧钒核苷复合物。
7)加入无RNA酶的胰DNA酶I至终浓度为2μg/ml,混匀,于37℃温育60分钟。
8)分别按10mmol/L和0.2%的终浓度加EDTA和SDS。
9)用等体积酚:氯仿抽提1次。
10)于室温以5000g离心10分钟使水相与有机相分相, 将水相吸至另一个离心管内,加3mol/L乙酸钠(pH5.2)至终浓度为0.3mol/L,加2.5倍体积用冰预次的乙醇,充分混匀,冰浴放置2小时。
11)用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟沉淀RNA。
12)吸出所有的乙醇,将打开管盖的离心管在实验台放置几分钟,让最后残存的痕量乙醇挥发干净。
13)用200μl TE(pH7.6)重溶沉淀,加500μl乙醇,于-70 ℃贮存备用。回收DNA时,只须取出1小份贮存液,加入3mol/L乙酸钠(pH5.2 )至终浓度为0.3mol/L,充分混匀,用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟即可。

三、注意事项
1.测定最终所得溶液的OD260值可以确定RNA的浓度。取10μl乙醇/TE混合液[步骤13)]离心沉淀RNA,以400水重溶, 测定OD260 值, OD260=1的RNA溶液每毫升约含40μg RNA。
2.如果需要,可用oligo(dT) -纤维素层析法从所制备的细胞总RNA中纯化无寡脱氧核糖核苷酸污染的mRNA或购买试剂盒进行mRNA的纯化。
3.某些情况下(例如从感染了DNA病毒或用DNA转染的细胞中制备RNA时),必须从细胞总RNA中去除寡脱氧核核苷酸。否则,当用这种RNA构建cDNA库或进行引物延伸反应时应会出问题, 反转录过程中法染的模板DNA片段可能会与RNA杂交而充当引物,从而导致物定mRNA5'末端定位的错误或产生截短的cDNA克隆。
a)步骤12后,加200μl 3mol/L乙酸钠(pH5.2),用自动微量移液器反复吹吸,以重悬核酸沉淀,将悬浮液移至另一个灭菌的微量离心管内。
b)用微量离心机于室温以12 000g离心10分钟,RNA沉于管底,而绝大部分寡脱氧核糖核苷酸仍在上清中。
c)弃上清液,用200μl TE(pH7.6)重溶沉淀。加入20μl 3mol/L乙酸钠(pH5.2),分混匀,加入550μl用冰预冷的乙醇。混匀溶液, 在冰上骤冷30分钟。用微量离心机于4℃以12 000g离主10分钟,以回收RNA。小心吸出上清。d)弃上清液,用300μl TE(pH7.6)重溶沉淀,加1ml乙醇,-70℃贮存备用。
回收RNA时,只需取出1小份贮存液,加3mol乙酸钠(pH5.2 )至终浓度为0.3mol/L充分混匀,用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟即可。如需去除氧钒核糖核苷复合物,用含0.1%羟喹啉的苯酚[用0.01mol/L Tris.Cl(pH7.8)平衡]将RNA终溶液抽提数次即可。
4. 对大多数细胞株来说, 一个直径90mm 培养甲中培养的RNA收率为100-200μg。

植物总RNA的分离编辑本段回目录

总RNA分离的方法很多,常采用的是异硫氰酸胍和-巯基乙醇这两种RNase抑制剂来抑制RNase的活性,同时,异硫氰酸胍与十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)共同作用可以破坏核蛋白复合体,使RNA顺利地解脱出来溶进缓冲液。由于RNA在碱性条件下不稳定,因而在整个提取过程中体系始终保持酸性至中性,而在酸性条件下DNA极少发生解离,DNA同蛋白质一起变性后被离心下来,RNA则仍溶于上清缓冲液中,最后用异丙醇沉淀出RNA。
【试剂与仪器】
(1)异硫氰酸胍溶液:
4 mol/L异硫氰酸胍
25 mmol/LM柠檬酸钠(pH 7.0)
0.5%十二烷基肌氨酸钠
0.1 mol/L -巯基乙醇
(2)2 mol/L NaAc(pH 4.0):用经EDPC处理过的水配制,高压灭菌。
(3)水饱和苯酚(pH 3.5)
【操作程序】
(1)取两只50ml离心管,各加入15ml异硫氰酸胍溶液,于冰上预冷。
(2)取5g新鲜的幼嫩植物组织放在研钵中,加入液氮,迅速研磨成均匀的粉末。
(3)将粉末全部移入冰上预冷的离心管中,振荡离心管混合均匀,将离心管置冰上。
(4)加入2mol/L NaAc 1.5ml、水饱和酚15ml和氯仿/异戊醇3ml,每加一种试剂都轻轻摇晃离心管混合均匀,最后将离心管盖紧,倒转几次混合均匀,冰浴15分钟。
(5)4℃条件下15000g离心30分钟将上层水相移至另一干净的离心管中,向管中加入等体积的异丙醇,混匀,置-20℃冰箱冷冻1小时。
(6)4℃条件下13000g离心25分钟,小心去除上清液,沉淀溶于5ml异硫氰酸胍溶液中(体积为第一次异硫氰酸胍溶液体积的1/3),再加入等体积的异丙醇,混匀后置-20℃冰箱冷冻1小时。
(7)4℃条件下13000g离心20分钟,沉淀用70%乙醇洗一遍,稍微晾干后,溶于适量体积(约500l)EDPC处理的水中。检测后分装,于-70℃低温保存。

应注意问题及解决的方法
(1)RNA分离提取后,可以通过紫外吸收值和走电泳来策略其浓度和质量。在分光光度计上测RNA的紫外吸收值A230、A260和A280,对于纯净的RNA样品,A260/A280的比值应介于1.7至2.0之间,如果比值太小,说明可能RNA样品中污染了蛋白或是苯酚。有好几种去除污染RNA的蛋白的方法,最简单的就是向RNA样品中加等体积的苯酚/氯仿(1/1)重新抽提一次,这样可以迅速地提高A260/A280的比例;当然,这样会损失大量的RNA,有时损失量达到40%。A260/A230的比值应该大于2.0,否则就可能是被异硫氰酸胍等污染了。这种情况下,必要时可以按照如下程序予以去除:①向RNA样品中加入1/10体积的2mol/L NaAc(pH4.0),然后加入等体积的异丙醇,在-20℃条件下放置30分钟。②4℃条件下10000g离心15分钟,沉淀用适当体积的1mmol/L EDTA溶解。③重复以上步骤。④用70℃乙醇洗一遍,真空抽干,沉淀溶于无RNase污染的水中。
从紫外吸收值的大小,可以比较精确地推算出RNA的量的多少,A260为1时相当于RNA浓度为37g/ml。在胶上看RNA的泳动情况似乎更加直观些,植物总RNA同其他真核细胞总RNA一样总是富含两种核糖体RNA,一种是28S rRNA,另一种是18S rRNA,这两种rRNA在变性胶上的泳动位置分别大致相当于5.1kb和2.0kb的位置,它们不但可以作为分子量大小的标准,还可以作为判断RNA样品完整性的标准。一般来说,经溴化乙锭染色后,如果28S rRNA条带亮度大约为18S rRNA条带的两倍,那么说明这个RNA样品比较完整,没有发生多少降解;如果亮度的比例倒过来了,就说明28S rRNA已部分降解成一种近似于18S rRNA的分子了,这样的RNA样品完整性就不好。
(2)RNA出现降解。出现这种情况主要有几个原因,操作过程中温度太高、操作时污染了RNase以及RNase抑制剂量不足等都有可能使RNA降解,因此,首先是要做好使用器皿的RNase去除工作,其次是在整个操作过程中最好在低温(4℃)或是冰上进行,操作者自始至终戴手套,如果走胶检查后发现RNA仍有降解,可以按照以下程序处理:
①先配好要用的盐酸胍溶液:
盐酸胍      57g
0.1 mol/L EDTA(pH7.0)  25ml
-巯基乙醇     75ml
DEPC处理的水加至总体积100ml
溶液配好后,用0.45m的滤头过滤灭菌。
②在抽提RNA最后一步真空抽干以后,将沉淀溶于10ml过滤好的盐酸胍溶液,用振荡器振荡助溶。
③向其中加入1/20体积的1mol/L Hac和3/4体积的无水乙醇,置-20℃条件下至少半小时,4℃10000g离心10分钟。
④重复以上步骤两次,每次重复体积均减半。
⑤用70℃乙醇洗一次沉淀,真空干燥,溶于适量的无RNase污染的水中,电泳检测。
(3)提出的RNA应保存于-70℃,避免频繁冻融。

植物mRNA的分离编辑本段回目录

植物细胞的mRNA同其他真核细胞mRNA一样,成熟后大多在其3’端挂上一条由约20~250个腺苷酸组成的多聚腺苷尾巴Poly(A),根据这一特征,我们可以通过亲和层析的方法将mRNA同其他的RNA分开来。亲和层析柱的介质可以同Oligo(dT)纤维素或Poly(U) sepharose,它们是分别含有10~20个核苷酸(T或U)的多聚链。在高盐条件下,带有Poly(A)尾巴的mRNA就会通过Poly(A)与Oligo(dT)或Poly(U)的结合挂在柱子上,而rRNA和tRNA由于没有这种尾巴结构无法结合在柱子上,因此就被洗下去了。然后我们就可以用低盐缓冲液将挂在柱子上的mRNA洗脱出来。
【试剂与仪器】
(1)上样缓冲液(1×):
20 mmol/L Tris•Cl(pH7.6)
0.5 mmol/L LiCl
1 mmol/L EDTA
0.1% SDS
高压灭菌,室温贮存。
(2)洗脱缓冲液:
10 mmol/L Tris•Cl(pH 7.6)
1 mmol/L EDTA
0.05% SDS
高压灭菌,室温贮存。
(3)Oligo(dT)纤维素
(4)4 mol/L NaAc(pH8.0)
(5)DEPC处理过的水。
【操作程序】
1.制备层析柱
(1)取一支硅化灭菌的巴斯德管,用洗净灭菌的玻璃棉塞上出口。
(2)取约5~15mg的Oligo(dT)纤维素悬浮于2ml上样缓冲液(1×)中,待Oligo(Dt)沉下去以后,小心移去上清液,再用上样缓冲液(1×)悬浮,重复几次至上清液完全清澈,备用。
(3)吸取Oligo(dT)悬浮液装柱,注意柱中不能流干,不要有气泡。用10ml上样缓冲液(1×)洗柱。
2.层析分离mRNA
(1)取一定体积的总RNA提取液,加入等体积的上样缓冲液(2×),于65℃加热7分钟,然后冰浴5~10分钟。
(2)待洗柱的上样缓冲液都过柱后,立刻取2ml样品上柱,收集流出液,然后重新上柱,重复5~6次。
(3)用10~100ml的上样缓冲液(1×)洗柱,除去rRNA,tRNA。
(4)将洗脱缓冲液置45℃水浴预热,待第3步洗柱液流出后,加200l洗脱缓冲液洗脱,重复5次,收集洗脱液。
(5)在分光光度计上测定各管洗脱液的RNA浓度(1.0A260=40l/ml mRNA)。
(6)向各管洗脱液中加入4mol/L NaAc(pH6.0)至终浓度为0.2mol/L,混匀,然后加入2.5倍体积的无水乙醇,置-70℃沉淀mRNA。
(7)使用时将管取出,10000 rpm离心5分钟,真空干燥沉淀,再溶于适量的DEPC处理的水中。
【应注意的问题及解决的方法】
(1)在测定光吸收之前,石英比色杯要浸泡在浓盐酸中,使用时用DEPC处理的水彻底冲洗干净。
(2)如果洗脱液在冰上变混浊,说明样品中有SDS污染。这时可将样品在冰上放置10min 12000g离心5min,将含有RNA的上清转至干净的Eppendorf管中。
(3)如果没有洗脱出mRNA,产生的原因可能有:①RNA样品与Oligo(dT)纤维素混合不充分;②洗脱不彻底;③沉淀不彻底。

PCR常见问题分析编辑本段回目录

*无扩增条带
常见问题 可能原因 建议解决方案
模板 模板中含有杂蛋白、Taq酶抑制剂等 纯化DNA模板,去除蛋白杂质或使用试剂盒提取模板DNA
 模板核酸变性不彻底 适当提高变性温度,延长变性时间。
 模板降解 重新制备模板。
引物 引物合成质量不佳 重新合成引物。
 引物降解 高浓度小量分装保存,防止多次冻融,避免长期置于冰箱冷藏部分。
 引物设计不合理(如引物长度不够,引物之间形成二聚体等) 重新设计引物(避免形成引物二聚体和二级结构)。
Mg2+浓度 Mg2+浓度偏低 适当提高Mg2+浓度:从1 mM到达3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物最佳镁离子浓度.
退火温度 退火温度过高,影响引物与模板的结合 降低火温度。
延伸时间 延伸时间短 增加延伸时间。

*假阳性
现象:阴性样品出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致
常见问题 可能原因 建议解决方案
PCR污染 靶序列或扩增产物的交叉污染 操作时应小心轻柔,防止将含靶序列的样品吸入加样枪内或溅出离心管外;试剂或器材应高压灭菌,破坏存在的核酸。
 试剂污染 各种试剂先进行分装,并低温贮存。
引物 引物设计不合适,选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性 重新设计引物。
*出现非特异性扩增
现象:PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者有时同时出现特异性扩增带与非特异性扩增
常见问题 可能原因 建议解决方案
引物 引物特异性差 重新设计引物。
 引物浓度过高 适当减少引物浓度。
Mg2+浓度 Mg2+浓度过高 适当降低Mg2+浓度,从1 mM到3 mM,间隔0.5 mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物最佳镁离子浓度.
耐热聚合酶 酶量过多 以0.5U为间隔适当减少酶量.
退火温度 退火温度过低 适当提高退火温度或采用二阶段温度法.
PCR循环次数 PCR循环次数过多 减少PCR循环次数.
*出现片状拖带或涂抹带
常见问题 可能原因 建议解决方案
引物 特异性差 重新设计引物,改变引物的位置和长度,增强基特异性.
模板DNA 模板不纯 纯化模板或使用试剂盒提取DNA.
耐热聚合酶 酶量过多 以0.5U为间隔适当减少酶量.
Mg2+浓度 Mg2+浓度过高 适当降低Mg2+浓度,从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度.
dNTP dNTP浓度过高 适当降低dNTP浓度.
退火温度 退火温度过低 适当提高退火温度
*50μl PCR反应体系中模板DNA的加入量?
人基因组DNA 0.1~1μg
大肠杆菌基组DNA 10~100ng
λDNA 0.5~5ng
质粒DNA 0.1~10ng
*如何进行长片段的扩增?
首先需选择正确的耐热聚合酶。 Long Taq DNA Polymerase是具有3′-5′外切核酸酶活性的耐热DNA聚合酶,扩增效率高并且错配率低,对简单模板可扩增长达1 kb的片段,对复杂二级结构(GC rich等)和具有重复序列的模板可良好扩增长达15 kb的片段。此外,较长产物的扩增还需要相应调整引物设计、延伸时间、变性时间和缓冲液pH等。引物使用标准方法设计,通常18~24mers会得到较好的产量。按1kb/分钟的速率增加延伸时间使DNA聚合酶完成聚合反应。为了保证有效的长片段扩增,可以将延伸温度设置为68℃左右。同时为防止模板损伤,在每个循环将94℃变性时间减少到30秒或更短,扩增前升温至94℃的时间应低于1分钟。
*如何提高PCR扩增的保真性?
下游应用为基因筛选、测序、突变检测和分子诊断的用户,对PCR保真性要求很高。降低PCR扩增的错误率可以通过使用各种具有高保真性的DNA聚合酶来实现。DNA聚合酶的保真度用错误率来表示,包括碱基错配率、PCR产物突变百分数等。在目前已发现的所有耐高温DNA聚合酶中,Pfu酶的出错率最低,保真度最高(见附表)。除对酶进行选择,研究者也可通过优化反应条件来进一步减少PCR突变率,包括优化缓冲液组成、耐热聚合酶的浓度及对PCR循环条件进行优化等。
附表:DNA聚合酶的扩增错误率
耐热DNA聚合酶 碱基错配率 *PCR产物突变百分数(%)
Pfu DNA Polymerase 1.3×10-6 2.6
Taq DNA Polymerase 8.0×10-6 16.0
VentR DNA Polymerase 2.8×10-6 5.6
Deep VentR DNA Polymerase 2.7×10-6 5.4
Tfl DNA Polymerase 8.3×10-6 16.6
Tbr DNA Polymerase 9.5×10-6 19.0
UITmaTM DNA Polymerase 55.3×10-6 110.6
*应用/acl分析,通过对/acl目标基因进行扩增和克隆,检测PCR产物突变百分数,从而测定DNA聚合酶的错误率。

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琼脂糖凝胶DNA回收常见问题分析编辑本段回目录

出现的问题 可能的原因 建议解决方法
核酸产量低或者纯度不高 试剂盒储存非最佳温度 存放在室温(15℃-20℃)
 洗脱液或者试剂暴露于减少它们有效性的条件下 每次用完后立刻盖紧盖子,以免溶液蒸发,pH改变和污染。
 漂洗液W中忘记加无水乙醇 第一次实验时,在漂洗液W中加入指定量无水乙醇。
 试剂没有和PCR凝胶溶液或其他要纯化的溶液充分混匀 加入每个试剂后都要充分混匀
洗脱后回收率低 使用了非最佳的洗脱液,洗脱液的高pH非常重要 不要用水洗脱,用试剂盒带的洗脱液EB.
回收后DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全 忘记做空离心,乙醇抑制了酶切反应 不要省去步骤8空离心,在空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发。
 一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应 将洗脱的回收DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用,
纯化的DNA产物OD260数值异常偏高
 一些硅基质膜成分一起洗脱下来,干扰了分光光度计读数 将洗脱的回收DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用,
洗脱液中不含DNA 在初始处理材料中没有PCR产物 开始回收前,用琼脂糖凝胶/EB电泳检测PCR产物。
回收后DNA的浓度太低 起始的处理材料中DNA含量太低 加大处理量和减少洗脱液的体积,但注意不要少于30μl。
 回收的片段小于100bp或者大于10Kb 片段小于100bp或者大于10bp回收效率都会迅速降低,可尝试提高起始处理量。
回收产量不高 使用的溶胶/结合液的量不足 确保PCR产物体积和溶胶/结合液的比例是1:3
PCR覆盖的油,蜡,上样液的颜料并不影响回收过程。
 洗脱不完全 可使用2次洗脱缓冲液EB洗脱(每次30μl),合并两次洗脱液。

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RNA提取常见问题分析编辑本段回目录


常见问题 可能原因 建议解决方案
柱子堵塞 裂解或匀浆处理不彻底 减少样品使用量,增加裂解液用量,增加匀浆和裂解时间。
 处理样品太多 减少样品使用量
得率低 裂解或匀浆处理彻底 减少样品使用量,增加裂解液用量,增加匀浆和裂解时间。
 处理样品太多 请参考最大处理量。
 RNA仍在柱上未洗出 加入RNase Free水后,放置几分钟再离心。
 洗出液中含有乙醇 漂洗后应再次离心,尽量去除漂洗液。
 未除净细胞培养液 收集细胞时,请注意尽量去除培养液。
OD260/OD280比值低 洗胶时使用RNase Free水 使用10mM Tris HCl,pH8.5作为洗脱液。
RNA降解 提取的材料不新鲜 新鲜组织取得后应立即至于液氮中,以保证提取效果。
 处理样品量过大 减少样品使用量。
 污染了RNase 虽然试剂盒中提供的缓冲液都不含RNase,但使用过程中很容易污染RNase,应小心操作。
DNA污染 处理样品量过大 减少样品使用量。
 有些样品本身DNA含量较高,可使用DNase处理 得到的RNA溶液可加入DNase处理,处理后可直接用于后续实验,也可用本试剂盒再进行一次纯化。

 DNA产物纯化常见问题分析
常见问题 可能原因 建议解决方案
回收率低或为零 漂洗缓冲液中没加入乙醇 在使用前应确保乙醇已加入漂洗液PW中。
 吸附材料上有乙醇残留 洗脱时硅胶膜树脂上有漂洗缓冲液裂留,因含乙醇会降低洗脱效率。在洗脱前可通过再次离心或置于50℃烤箱中5~10分钟,彻底去除漂洗缓冲液。
 洗脱缓冲液pH值偏低 DNA只在低盐buffer中才能被洗脱,如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl,pH8.5)或水。洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH7.0~8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内。
 洗脱液加入位置不对 洗脱液应加在硅胶膜中心部位,以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面,达到最大洗脱效率。
DNA质量不好 洗脱产物含有乙醇残留 洗脱时硅胶膜或硅胶树脂上有漂洗缓冲液残留,会使洗脱产物中含有乙醇,影响下游操作。在洗脱前可通过再次离心或置于50℃烤箱中5~10分钟,彻底去除漂洗缓冲液。

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DNA电泳常见问题分析编辑本段回目录

问题 原因 解决方案
DNA带模糊 DNA降解 避免核酸酶污染
 电泳缓冲液陈旧 电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH值上升,缓冲能力减弱,从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。
 所用电泳条件不合适 电泳时电压不应超过20V/cm,温度<30℃;巨大DNA链电泳,温度应<15℃;核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
 DNA上样量过多 减少凝胶中DNA上样量
 DNA样含盐过高 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐
 有蛋白污染 电泳前酚抽提去除蛋白
 DNA变性 电泳前勿加热,用20mM NaCl缓冲液稀释DNA
不规则DNA带迁移 对于λ Hind III片段cos位点复性 电泳前于65℃加热DNA5分钟,然后在冰上冷却5分钟.
 电泳条件不合适 电泳电压不超过20V/cm;温度<30℃;经常更换电泳缓冲液
 DNA变性 以20 mM NaCl Buffer稀释DNA,电泳前勿加热
带弱或无DNA带 DNA的上样量不够 增加DNA的上样量;聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏席稍高,上样量可适当降低。
 DNA降解 避免核酸酶污染
 DNA走出凝胶 缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度
 对于EB染色的DNA,所用光源合适 应用短波长(254nm)的紫外光源
DNA带缺失 小DNA带走出凝胶 缩短电泳时间,降低电压,加大凝胶浓度
 分子大小相近的DNA带不易分辨 增加电泳时间,核准正确的凝胶浓度。
 DNA变性 电泳前请勿高温加热DNA链,以20 mM NaCl Buffer稀释DNA。
 DNA链巨大,常规凝胶电泳不合适 在脉冲凝胶电泳上分析。

 DNA产物回收试剂盒常见问题分析
出现的问题 可能的原因 建议解决方法
核酸产量低或者纯度不高 试剂盒储存非最佳温度 存放在室温(15℃-20℃)
 洗脱液或者试剂暴露于减少它们有效性的条件下 每次用完后立刻盖紧盖子,以免溶液蒸发,pH改变和污染。
 纯化结合液BD、漂洗液W中忘记加无水乙醇 第一次实验时,在纯化结合液BD、漂洗液W中加入指定量无水乙醇。
 试剂没有和PCR样品及其他要纯化的溶液充分混匀 加入每个试剂后都要充分混匀
洗脱后回收率低 使用了非最佳的洗脱液,洗脱液的高pH非常重要 不要用水洗脱,用试剂盒带的洗脱液EB.
回收后DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全 忘记做空离心,乙醇抑制了酶切反应 不要省去空离心,在空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发。
 一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应 将洗脱的回收DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用,
纯化的DNA产物OD260数值异常偏高 一些硅基质膜成分一起洗脱下来,干扰了分光光度计读数 将洗脱的回收DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用,
  
洗脱液中不含DNA 在初始处理材料中没有PCR产物 开始回收前,用琼脂糖凝胶/EB电泳检测PCR产物。
回收后DNA的浓度太低 起始的处理材料中DNA含量太低 加大处理量和减少洗脱液的体积,但注意不要少于30μl。
 回收的片段小于100bp或者大于10Kb 片段小于100bp或者大于10bp回收效率都会迅速降低,可尝试提高起始处理量。
回收产量不高 使用的结合液的量不足 确保PCR产物体积和结合液的比例是1:3
  PCR覆盖的油,蜡,上样液的颜料并不影响回收过程。
 洗脱不完全 可使用2次洗脱缓冲液EB洗脱(每次30μl),合并两次洗脱液。 

质粒提取常见问题分析编辑本段回目录

常见问题 可能原因 建议解决方案
未提出质粒或质粒得率较低
 大肠杆菌老化 请涂布平板培养后,重新挑选新菌落进行液体培养。
 质粒拷贝数低 由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低,可更换具体相同功能的高拷贝数载体。
 菌体中无质粒 有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在,经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如,柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定,因此不要频繁转接,每次接种时应接种单菌落。另外,检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
 碱裂解不充分 使用过多菌体培养液,会导致菌体裂解不充分,可减少菌体用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。对低拷贝数质粒,提取时,可加倍使用溶液P1、P2和P3,可能有助于增加质粒提取量和质料质量。
 溶液使用不当 溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊,应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液,才能使用。
 吸附柱过载 不同产品中吸附柱吸附能力不同,如果需要提取的质粒量很大,请分多次提取。若用富集培养基,例如TB或者×YT,菌液体积必须减少;若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率,则需调整LB培养液体积。
 质粒未全部溶解 洗脱溶解质粒时,可适当加温或延长溶解时间。
 乙醇残留 漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体,树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂,再加入洗脱缓冲液。
 洗脱液加入位置不正确 洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。
 洗脱液不合适 DNA只在低盐溶液中才能被洗脱,如洗脱缓冲液EB(10 mM Tris•Cl, pH8.5)或水。洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH7.0~8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内,如果pH过低可能性导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。
 洗脱体积太小 洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高,但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。
 裂解时间过长 加入溶液P2后裂解时间不应超过5分钟。
 洗脱时间过短 洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置一分钟可达到较好的效果。

 

质粒纯度不高 混有蛋白 不要使用过多菌体。溶液P1、P2、P3处理并离心后溶液应为澄清的,如果还混有微小蛋白悬浮物,可再次离心去除后再进行下一步骤。
 混有RNA RNase A处理不彻底 减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如果溶液P1已保存6个月以上,请在溶液P1中添加RNase A。
 混有基因组DNA 加入溶液P2和P3后应温和混匀,如果剧烈振荡,可能反基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠,无法温和混匀,请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解,不要超过16小时。
 P3溶液加入时间过长 P3溶液加入后,放置时间不要太长,否则有可能会产生小片段DNA污染。
 含大量核酸酶的宿主菌 有些宿主菌含大量核酸酶,在质粒提取过程中降解质粒DNA,影响提取质粒DNA的完整性,最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌,如DH5 α和Top10。
 乙醇残留 漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体,树脂型试剂盒漂洗晾干树脂,再加入洗脱缓冲液。
 质粒的二聚体和多聚体形式 是在质粒复制过程中形成的,与宿主菌相关,电泳可检测出。

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凝胶电泳操作注意事项编辑本段回目录


1、 琼脂糖:不同厂家、不同批号的琼脂糖,其杂质含量不同,影响DNA的迁移及荧光背景的强度,应有选择地使用。
2、 凝胶的制备:凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致,溶化的凝胶应及时倒入板中,避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡,以免影响电泳结果。
3、 电泳缓冲液:为保持电泳所需的离子强度和pH,应经常更新电泳缓冲液。
4、 样品加入量:一般情况下,0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当减少加样量,但是上样量过多会造成加样孔超载,从而导致拖尾或弥散,对于较大的DNA此现象更明显。
5、 DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率,平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。
6、 DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度,迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,以提高分辨率。

实验:DNA片段的回收及纯化编辑本段回目录

实验目的
    了解琼脂糖凝胶电泳中回收DNA片段的常用方法,掌握根据实际情况选用方法的原则,并用试剂盒从琼脂糖凝胶中回收PCR产物DNA片段。
实验原理
    DNA片段的分离与回收是基因工程操作中一项重要的技术,例如可收集特定酶切片段用于克隆或是制备探针,回收PCR产物用于再次鉴定等。回收实验中两个最重要的技术指标是产物的纯度与回收率:纯度未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应;回收率不理想时往往会大大增加前期工作量。
    1.低熔点胶法  低熔点胶是向普通琼脂糖的多糖链上引入羟乙基形成的,这一变化会使凝胶的熔化点与凝固点均降低。低熔点胶在30℃时凝结、65℃时熔化,这一温度尚不足以使DNA分子变性。操作时可先灌一块普通的胶,然后用低熔点胶取代其中的回收部分。割下的胶加入TE后于65℃保温促使凝胶熔化,再加入等体积的酚抽提去除凝胶。低熔点胶的另一个特点是电泳回收后可以立即进行酶切连接、标记等酶反应,因为这类胶中不含有普通琼脂糖中抑制酶活性的硫酸盐等杂质,并且收集的胶条能在酶反应的合适温度(37℃)始终保持液体状态。
    2.玻璃粉(乳)法  将胶条割下加入NaI溶液浸泡,剧烈振荡数分钟促使溶胶。向胶液中加入经酸净化处理的极细玻璃粉(乳),室温反复倒转离心管使DNA吸附于其上。离心收集玻璃粉后加入TE并于37℃保温,洗脱吸附于玻璃粉上DNA,再次离心收集含DNA的上清液即可。玻璃粉法适用于回收0.4~1kb的小分子片段,均有80%的回收率。
    3.QIAgen胶回收试剂盒  由于凝胶溶于含NaI的溶胶液,DNA能专一地与离心柱中纤维素结合。结合后的DNA经洗涤除去杂质,最后在低盐缓冲液中经离心从纤维素上洗脱下来。
    4 其他试剂盒,本实验采用的是北京塞百盛生物技术公司的PCR产物回收试剂盒。基本原理是,在高盐状态下,纯化树脂专一性地吸附DNA;而在低盐或水溶液状态下,DNA被洗脱下来。此法简便快捷,可在几分钟内从PCR反应液,或十几分钟内从普通琼脂糖凝胶中回收高纯度的PCR产物,用于DNA测序及其它酶促反应。其回收率分别为85%和70%左右。该系统不仅用于纯化PCR产物,还可以从反应液或普通琼脂糖凝胶中回收各种类型的DNA片段,适用范围从150bp到十几kb。
实验内容
试剂与器材
   试剂
    (1)琼脂糖
    (2)TAE电泳缓冲液
    (3)10×DNA电泳样品缓冲液
    (4)无菌水
    (5)PCR产物
(6)溴化乙锭(EB)
(7)试剂盒包装及组成
1、纯化树脂 (于GS结合液中) 20ml
2、离心纯化柱(空柱子) 50套
(8)80%异丙醇或80%乙醇
(9)超纯水或TE缓冲液
仪器
(1)台式高速离心机
(2)水浴锅
(3)电泳器材
实验步骤
   1. 将无石蜡油的PCR反应液或酶切反应液(50μl~100µl反应体系)在1%的普通琼脂糖凝胶上电泳,切下所需的DNA条带装入2ml离心管中。
          尽量切掉不含DNA的琼脂糖凝胶,这样可简化操作、提高回收量及DNA片段的质量。
      2. 200mg~400mg琼脂糖凝胶中加入0.4ml纯化树脂(使用前充分混匀),70℃保温5~10分钟,每两分钟颠倒混匀1次,使琼脂糖凝胶完全融化。
      对于高浓度的琼脂糖凝胶(>2%),每200mg的琼脂糖凝胶中加入0.5ml纯化树脂,加热融胶的时间延长到15分钟。
      3. 将混和液转移入离心纯化柱,13,000rpm离心30秒,倒掉收集管中的废液。
      4. 加入500µl 80%异丙醇(或乙醇),13,000rpm离心30秒,倒掉收集管中的废液。
          重复第4步一次,此步骤13,000rpm离心2分钟,务必将异丙醇 (或乙醇)除尽。如果离心纯化柱上还残留有异丙醇(或乙醇),13,000rpm再离心1分钟。
      5. 将离心纯化柱套入干净的1.5ml或2ml离心管中,开盖放置2~3分钟,务必使乙醇充分挥发干净,加入40µl TE缓冲液(若用于测序,则加40µl超纯水)于纯化树脂上,不能粘在管壁上。放置2分钟后,13,000rpm离心30秒。
          TE缓冲液或超纯水的用量视用户对浓度的要求而定。离心纯化柱放入离心管中,若盖不上盖子,亦没有关系,可开盖离心。
      6. 离心管中的液体即是纯化的DNA片段,取4µl电泳(0.8%琼脂糖,120V,10分钟)检测并目测定量。-20℃保存备用。

注意事项
1 低熔点胶回收DNA时,切除不含样品的凝胶,保证样品凝胶尽可能地要小。
2 室温低于25℃时,纯化树脂 (于GS结合液中)可能出现结晶或盐析,此时请务必预热,使其完全溶解后使用。。
3 纯化树脂(于GS结合液中)为灰褐色粉状物质,静置时沉淀于瓶底,使用时要充分混匀。

实验:RNA的提取及其纯度检测编辑本段回目录

实验目的: 了解Trizol提取总RNA的原理,掌握高质量完整总RNA提取的技术以及电泳变性胶电泳检测和浓度及纯度鉴定方法。

实验原理
   Trizol是一种酚与异硫氰胍的混合物,非常容易把组织和细胞中的总RNA提取出来。在加入氯仿离心后,RNA保留在水相中,与DNA和蛋白质分离开来(保留在有机相中)。吸取水相,加入异丙醇成淀RNA,从而得到完整纯度高的总RNA。

实验内容
材料 小鼠新鲜肝
试剂
总RNA提取纯化试剂:Trizol(Invitrogen);DEPC(Amersham),无水乙醇,已丙醇;
电泳试剂:MOPS,甲酰胺,甲醛,上样缓冲液(50%甘油,10 mM EDTA,0.25% 溴酚蓝,0.25%二甲苯青),琼脂糖。

操作步骤
总RNA的提取
1小鼠肝组织的匀浆裂解
断颈处死小鼠,立即解剖取出肝脏,取50-100mg到玻璃匀浆器中,假如1mlTrizol反复匀浆膜碎组织,使细胞完全裂解。按1 ml Trizol加入0.2 ml氯仿,震荡15秒,室温放置3分钟,12000×g,4℃离心15分钟。
2 RNA的沉淀
将离心的上清转移到新的离心管中,按1 ml Trizol加入0.5ml异丙醇,震荡15秒,室温放置10分钟,12000×g,4℃离心10分钟。
3 RNA的洗涤与溶解
吸掉上清,加入1 ml 75% 乙醇洗涤沉淀,4℃,7500×g离心5分钟。吸掉上清,空气干燥RNA沉淀10分钟,加入适量的DEPC处理水溶解RNA,立即电泳和紫外浓度和纯度鉴定,剩余-20℃保存备用。

在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳
甲醛蒸气有毒,含有甲醛的溶液应在化学通风橱内配制,装有甲醛溶液的电泳槽应尽可能盖严。
1、配制5×甲醛凝胶电泳缓冲液:
         5×甲醛凝胶电泳缓冲液
         0.1mol/L            MOPS(pH7.O)
         40mmol/L            乙酸钠
         5mmol/L             EDTA(pH 8.O)
    将20.6g 3-(N-玛琳代)丙磺酸(MOPS)溶于800ml经用DEPC处理的50mmol/L乙酸钠溶液(用DEPC处理溶液的方法见344页)。用2mol/L氢氧化钠将溶液的pH值调至7.0,加10ml经用DEPC处理的0.5mol/L EDTA(pH 8.0),再加经用DEPC处理的水至溶液总体积为1L.上述溶液经用 0.2um微孔滤膜过滤除菌,避光保存于室温。光照或高压后溶液逐渐变黄,淡黄色的缓冲液可正常使用,而深黄色缓冲液则不然。
      小心:DEPC有致癌之嫌,须小心操作。
2、制备凝胶:将适量琼脂糖熔于水,冷却至60℃,加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液和甲醛至终浓度分别为1×和2.2mol/L(将12.3mol/L甲醛贮存液、琼脂糖水溶液和5×甲醛凝胶电泳缓冲液按1:3.5:1.1比例混合即可)。在化学通凤橱内灌制凝胶。于室温放置30分钟或更长时间,使凝胶凝固。
    甲醛(分子量30.03)通常为37%的水溶液(12.3mol/L),应确证这一浓溶液的pH值大于4.0.
3、 在一灭菌的微量离心管内混合下列液体,以制备样品:        
 RNA(多达30ug)               4ul      
 5x甲醛凝胶电泳缓冲液         21ul       
甲醛                           3.5ul       
甲酰胺                        10.0ul  
 于65 C温育15分钟,冰浴冷却,离心5秒钟使管内所有液体集中于管底。
4、 加2ul灭菌的并经用DEPC处理的甲醛凝胶加样缓冲液。
      甲醛凝胶加样缓冲液 
          50%              甘油
          1mmol/L          EDTA(pH8.0)
          0.25%           溴酚蓝
          0.25%            二甲苯青FF          
5、加样前,将凝胶预电泳5分钟,电压降为5V/cm,随后将样品加至凝胶加样孔。
6、将凝胶浸入1×甲醛凝胶电泳缓冲液中,3-4V/cm电压降进行电泳。
7、电泳结束后浸入溴化乙锭溶液(0.5ug/m1,用0.1mol/L乙酸铵配制)中染色30-45分钟。
 与未变性的琼脂糖凝胶相比,含甲醛的凝胶较为脆弱,故应小心操作。
 
结果
在凝胶上可以看到一般可以看到三条带,其中从上样孔开始对应的带的分别是28S,18S和5S,其中18S和28S的条带明显清晰,而5S的带比较弱,28S的带的亮度是18S带亮度的2背左右,说明RNA保持完整。

紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度
总RNA用10mM的Tris-HCl(pH8.0)稀释,利用紫外分光光度计测定A260和A280值,根据1OD=40ug定量,并计算A260/A280比值,每一样品重复3次。
如果A260/A280比值均在2.0以上(2.0-2.2之间),说明RNA的纯度很好。

注意事项
创造无Rnase的环境
注意以下几点,以防止Rnase污染样品,保证分离到全长mRNA:
1、 手和空气中的细菌霉菌是主要的Rnase污染源。为防止污染,应在超净台上无菌操作。这些试剂都要反复使用,所以开启和关闭试剂瓶一定防止污染。一直带塑料手套。
2、最好用一次性使用塑料制品提RNA,这些制品常是无RNase的,无须灭活RNase。
3、不是一次性使用的玻璃和塑料制品,用前应除RNase。玻璃制品应于200℃烘烤过夜,塑料制品用前用0.1N NaOH,1mM EDTA作彻底冲洗,再用无RNase水冲洗。
4、用户自备的溶液应用0.05%DEPC处理过夜,再高压灭菌30分钟以出去痕量DEPC。

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