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等电聚焦电泳介绍

标签: 等电聚焦电泳 介绍

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主要仪器试剂

仪器:微型电泳系统、电源、注射器、固定和染色用容器

试剂:丙稀酰胺、双-丙稀酰胺、载体两性电解质、尿素、过硫酸胺、TEMED、TritonX-100、2-巯基乙醇、溴酚蓝、磷酸、氢氧化钠、氯化钾、三氯乙酸、考马斯亮蓝、甲醇、乙酸。

储存液:1)30%(w/v)丙稀酰胺,1%(w/v)双-丙稀酰胺;2)20%Triton X100;3)10%三氯乙酸;4)1%三氯乙酸;5)1%溴酚蓝;6)考马斯亮蓝染色液;7)考马斯亮蓝脱色液;

灌胶

以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6变性等电聚焦凝胶的配方。其他pH范围等电聚焦可以参考表格来配置。

水:5.4ml; 储存液1):2.0 ml; 载体两性电解质溶液pH3.5-10 48μl; 载体两性电解质溶液pH4-6 240μl; 超纯尿素 6.0 g ;10%过硫酸胺25μl; TEMED:20μl

灌胶步骤:

1.组装灌胶器;

2.将尿素、水、溶液和载体两性电解质溶液混匀,避免剧烈摇动,轻微加热尿素溶解更快(带手套,丙稀酰胺有毒);

3.加入过硫酸胺和TEMED,轻轻混匀(开始聚合,操作要迅速);

4.将上述混匀溶液倒如灌胶器(尽量避免气泡产生);

5.插入梳子,将梳子侵入胶内(不要产生气泡);

6.聚合约1小时;

7.聚合完成,小心拔去梳子;

8.将凝胶同冷却装置连接后插入电泳池,蛋白样品上样前最好用阳极电极液注入上槽中确定是否有渗漏。

注意:

1.上样前冲去上样空底部未聚合的丙稀酰胺,否则电泳过程中会发生聚合;

2.现在有商品化的等电聚焦凝胶,但只限于水平平板电泳系统(如Pharmmacia-LKB,Hoefer).

样品制备和上样

一般不同厚度的凝胶,不同的梳孔数目会有不同的上样量,例如:0.75mm厚、15孔的凝胶每孔最大上样量大约15μl。

变性凝胶上样缓冲液2×Buffer(适用于pH4-6):1)尿素:2.4g;2)pH3.5-10载体两性电解质:20μl;3)pH4-6载体两性电解质:100μl;4)20%Triton X-100:500μl:5)2-巯基乙醇:50μl;双蒸水:1.7ml;1%溴酚蓝:200μl

电泳:

操作步骤:

1.将蛋白样品于等体积的2×上样缓冲液混合,10000×g离心5min以除去蛋白质沉淀;

2.用微量注射器将蛋白质样品加入到上样空底部,注意不要溢出来。注意:对于考马斯亮蓝染色液来说,每个泳道10-30μg的蛋白混合粗提物(我们俗称粗抗原)或者5-10μg单一蛋白组分是较合理的上样浓度。

电泳液:

1.上槽中加入阴极电泳液(20mM氢氧化钠:须由1M储存液新鲜配置);

2.下槽中加入阳极电泳液(10mM磷酸:须由1M储存液新鲜配置)。

等电聚焦电泳条件:

1.接好电极;

2.恒压150V电泳30min;

3.恒压200V电泳2.5h,开始时候控制电流为10mA左右,在聚焦过程中电流有所下降,电泳内室温度在电泳的过程中将升至40-50摄氏度。

电泳聚焦后处理:

测定pH梯度:

1.将凝胶条切成0.5cm或1cm的小片;

2.将每小片凝胶在1ml 10mM KCl中 浸泡30min;

3.测读此KCl溶液的pH值、

凝胶的固定:

1.将凝胶于10%三氯乙酸中浸泡10min;

2.换成1%三氯乙酸溶液继续浸泡至少2h以上,以去除载体两性电解质,浸泡过夜可以更好的降低考马斯亮蓝对载体两性电解质的染色。

凝胶的染色:用考马斯亮蓝染色,然后脱色,制成干胶。

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