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标签: 高压电泳 分离

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原理:同普通电泳。普通电泳的电压一般为2V/cm~20V/cm,电泳时间需1小时至数小时。电泳时间越长,扩散越严重。对于一些小分子的物质如核苷酸、氨基酸、多肽等,在常压电泳中,往往达不到分离的目的。高压电泳则能使分子量相近的物质充分地进行分离。在高压电泳中,电压可达到50V/cm~200V/cm,高压电源达1 500V~1 0000V,电流可达50mA~400mA.电压越高,分离时间越短,所以在高压电泳中,一般只需较短的时间,数十分钟,有的甚至数分钟即可达到分离的目的。高压电泳广泛地用于核苷、核苷酸、氨基酸、多肽、糖、生物碱、有机酸等的分离。

高压电泳中最大的问题是冷却,常用的冷却方式有三种,即固体冷却、液体冷却和气体冷却。其中以液体冷却设备简单、效果也好。液体冷却剂的选择必须遵循以下几点:①与缓冲液互溶性小;②不溶解样品;易从纸上除去;不以爆炸;蒸汽不是剧毒性物质。一般常用的冷却剂有甲苯、四氯化碳、液体石蜡、氯苯、正己烷、乙庚烷等。以甲苯冷却效率最高。

材料与试剂

1.0.05mol/L pH4.85柠檬酸缓冲液

2.5-AMP、ADP、ATP,每种核苷酸溶液的浓度为5mg/ml。

3.AMP-ADP-ATP混合液。取上述三种核苷酸溶液等体积混合而成。

4.点样管、毛细管

5.新华1号滤纸

6.玻璃喷雾器

7.高压电泳仪

8.聚乙烯膜等

操作方法

1.剪纸 剪适当大小滤纸,一般为60cm×10cm。

2.点样 点样的位置取决于样品的性质和缓冲液的pH,如不明确泳动方向,则点中线处。核苷酸在pH2~5均带负电荷,点靠负极一些。量为50μg~100μg,要求分离后每个斑点在5μg以上,否则在紫外灯下很难检查出来。点样时,样品越少越好,样品剂量较大时,可边点边用吹风机吹干,分数次点。注意勿伤纸面,不要把纸刮毛或弄皱。

3.电泳 以0.05Mol/L pH4.85柠檬酸缓冲液,用玻璃喷雾器将滤纸喷湿,然后将喷湿的滤纸夹在二滤纸之间,以吸去多余的液体。将湿滤纸夹在两张聚乙烯膜之间,该膜使滤纸与冷却板绝缘,将此“夹层”夹在两块冷却板之间,旋紧冷却板的螺丝。在滤纸两头与电极槽缓冲液之间用数层滤纸搭桥,将电泳仪上的安全盖盖好,把冷却板上入水孔用橡皮管连上。将电表头电压调至4 000V,此时电流为28mA~30mA,相当于电势差66.6V/cm,电流2.8mA/cm~30mA/cm,通电20min,断电。迅速取出滤纸,吹干。

结果判定:用紫外灯(波长260nm)观察滤纸上的核苷酸分离情况。参照核苷酸的移动位置,可以确定结合物(样品)中有何种核苷酸。也可以根据实验条件,先确定各种标准核苷酸的迁移率作为分析的依据。

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