实验试剂：

试剂贮备液：

1、 1mol/L HCl48ml，Tris36.6g，TEMED0.23ml，加蒸馏水配成100ml，pH8.9。

2、 1mol/L HCl48ml，Tris5.98g，TEMED0.46ml，加蒸馏水配成100ml，pH6.7。

3、 Acr28g，Bis0.735g，加蒸馏水配成100ml。

4、 Acr10g，Bis2.5g，加蒸馏水配成100ml。

5、 核黄素4mg，溶于100ml蒸馏水中。

6、 蔗糖40g，加蒸馏水配成100ml。

7、 电极缓冲液：Tris6.06g，甘氨酸28.52g，加蒸馏水配成1000ml，pH8.3，用时稀释10倍。

8、 过硫酸铵0.14g，加蒸馏水配成100ml。

9、 溴酚蓝1mg溶于100ml蒸馏水中。

10、 脱色溶液：甲醇5ml，冰醋酸9ml，加蒸馏水配成100ml。

11、 蛋白质染色液：考玛斯蓝G─250 200mg，甲醇100ml，冰醋酸20ml，蒸馏水80ml，溶解后混合之。

12、 过氧化物酶染色液：

1) 染色液甲：联苯胺─抗坏血酸染色液，染色数分钟。抗坏血酸70.4mg，联苯胺溶液20ml（2g联苯胺溶于18ml用文火加热的冰醋酸中，再加蒸馏水72ml），0.6%过氧化氢20ml，蒸馏水60ml。

2) 染色液乙：联茴香胺染色液，染色至少1小时。0.1mol/L醋酸缓冲液，pH5.5（0.82g醋酸钠溶于80ml蒸馏水中，用醋酸调节至pH5.5，定容至100ml）。30%H₂O₂0.25ml溶于50ml蒸馏水中，用时新鲜配制。邻联茴香胺（o─dianisidine）100mg，溶于100ml醋酸缓冲液(1)中。用时取溶液（2）5ml，溶液（3）50ml，混合之。

实验步骤：

凝胶的制备：

1、 清洗干净两块玻璃板，晾干后按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。

2、 将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角。把玻璃板在灌胶支架上固定好。

3、 分离胶：按1∶3∶8∶水=1∶2∶4∶1的比例，先将贮备液1，3和水放在一小烧杯中，过硫酸铵贮备液放在另一小烧杯中，一起放在真空干燥器中，用真空泵抽气15分钟，取出将过硫酸铵溶液并入，用玻棒轻轻搅动使之混合，立即注于干洁的玻璃板中。玻璃板垂直放置，用滴管吸取混合液，沿管壁注入，注意不要进入气泡。胶液注到离玻璃板口2cm处，立即在其表面覆盖少量蒸馏水，静置1小时左右，当见到水层下面有一清晰的界面时，则表明胶已聚合凝固，用吸水纸小心吸去上面水层。

4、 浓缩胶：按2∶4∶5∶6=1∶2∶1∶4的比例，同上法制备浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟。

电泳步骤：

1、 拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖。

2、 用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。

3、 电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。

4、 凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。

5、 脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到区带清晰。

6、 实验结果分析。

注意事项：

1、 固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。

2、 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。

3、 水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。

4、 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。

5、 样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。

6、 要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果。

7、 注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。

8、 为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.

9、 剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。