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判断PCR阳性的标准

标签: PCR 阳性 标准

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一、条带宽不超过1mm,边缘整齐;

二、条带在期望的碱基大小之内;

三、背景上无smears,也无引物二聚体的出现则是PCR扩增失败,而非阴性反应;

四、如果出现期望的碱基大小之外的其它条带,不管是否有期望大小的条带,均应作为人工假像看待;

五、在临床标本检测时,尤其对于肿瘤标本,除预期条带外,经常有以外条带或smear现象,但只要其亮度明显低于目的条带,也应视为阳性;

六、对于某些情况,尤其在自己设计引物时,如果经费允许,还是应该抽样测序验证。因为用一对引物扩出同一家族不同成员的情况也是有的,如果恰巧这些成员长度相等,则用上述原则无法判别。比如当我在扩MAGEs基因时,曾经一对引物扩出其家族的6个成员,产物均是1000bp左右。实际是MAGE1-6,要是你的原则,那都是MAGE3了。还有我曾用一对引物扩出小鼠,大鼠,兔,人,豚鼠的IgG 1Fc产物均为750bp;

七、阴性反应我理解为:由于模板的不存在而使PCR扩增失败。所以是否阴性反应还应和阴性对照相比较。阴性反应没有二聚体和Smaer现象情况并不少见;当然最常见的情况还是二聚体和Smear现象(我们这称为“大马路”);

八、条带整齐就可以了,1mm的标准无法实施,条带越小,胶越稀,跑得越远,带越宽。做这些试验,往往是研究生,新手上路,不必要求太严格了。

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