生命经纬知识库 >>所属分类 >> PCR技术   

抑制消减杂交SSH步骤

标签: 抑制消减杂交 SSH 步骤

顶[0] 发表评论(119) 编辑词条

一、cDNA第一链的合成

1、在0.5ml经DEPC处理过的离心管中分别加入tester和driver的mtRNA各2ug,然后加入1ul(10uM) 随机引物(9mer),70℃温浴2min,然后迅速置于冰上放置2min,然后在每管中加入如下混合物:

5×First-strand Buffer 2ul
dNTPs Mix(10mM) 1ul
sterile H2O 1ul
AMV Reverse Transcriptase(20U/ul) 1ul

2、42℃反应1.5hr,然后将离心管置于冰上,终止cDNA第一链的合成,然后马上进行第二链的合成。

二、cDNA第二链的合成

1、在已经合成好cDNA第一链的离心管中加入每管如下反应物,16℃反应2hr:

sterile H2 48.4ul
5×Second-strand Buffer  16.0ul
dNTPs Mix(10mM) 1.6ul
20×Second-strand Enzyme Cocktail  4.0ul

2、加入2ul(6U)T4 DNA Polymerase,16℃反应30min。

3、加入20×EDTA/Glycogen Mix 4ul,以终止反应。

4、加入100ul 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,并沉淀出cDNA双链,溶解于50ul双蒸水中。

三、cDNA质量检测

根据一个油菜线粒体基因Ccl1(GI:1694628)的cDNA序列设计特异性引物(CF:5′-TGA CAC GAG ATG ATA AAG A-3′  CR:5′-CGT AAC AAT AGA GCA GGA TAG-3′),目标片段大小为427bp。以反转录所得cDNA为模板,若PCR扩增能得到目标片段,说明线粒体mRNA已经成功反转录。

四、Rsa I酶切双链cDNA

1、tester和driver cDNA经37℃过夜酶切,酶切体系为:

ds cDNA 43.5ul
10×Rsa Restriction Buffer 5.0ul
Rsa I(10U/ul) 1.5ul

2、每管用2.5ul EDTA/Glycogen混合物终止反应。

3、加入50ul 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,并沉淀出酶切后的cDNA双链,溶解于5.5ul双蒸水中。

五、接头连接

酶切消化的tester双链cDNA分为两份,一份与Adaptor1连接,另一份与Adaptor2连接,具体步骤如下:

1、取1ul酶切的tester ds cDNA用5ul ddH2O稀释;

2、连接反应液(Ligation Master Mix)的制备如下:

sterile H2O 3ul
5×Ligation Buffer 2ul
T4 DNA Ligase 1ul

3、在两个EP管中分别加入如下试剂:

component Tester1-1 Tester1-2
diluted tester cDNA 2ul 2ul
Adaptor1(10Um) 2ul /
Adaptor2(10Um) / 2ul
Ligation master mix 6ul  6ul 
Final volume 10ul 10ul

4、在另一离心管中混合1.5ul tester1-1和1.5ul tester1-2,连接反应完成后即为本实验所需要的unsubtracted tester control 1-c;

5、轻微离心,16℃过夜连接;

6、加入1ul 20×EDTA/Glycogen Mix,终止反应;72℃温育5min使ligase失活;

7、取1ul unsubtracted tester control 1-c,用1ml ddH2O稀释,该样品将用来进行PCR检测;

8、所有样品放入-20℃保存。

六、第一次杂交

1、每个杂交反应的体系为:

component Hybridzation sample 1  Hybridzation sample 2
Rsa digested driver cDNA  1.5ul 1.5ul
Tester1-1(ligated adaptor1) 1.5ul /
Tester1-2(ligated adaptor2) / 1.5ul
4×Hybridzaion Buffer  1ul 1ul
Final volume 4ul 4ul

2、每个反应管中加一滴矿物油覆盖,短暂离心;

3、98℃ 5min,使DNA充分变性;

4、68℃ 杂交10小时(杂交时间不少于6小时,也不能超过12小时),完成后立即进行第二次杂交。

七、第二次杂交

1、配制第二次杂交混合液

Driver cDNA 1ul
4×Hybridzaion Buffer  1ul
sterile water 2ul

2、取1ul混合液加一滴矿物油覆盖后于PCR仪上98℃变性1.5min。

3、将移液器调到15ul,轻轻将枪头伸入Hybridzation sample 2中矿物油与液面交界出,小心将样品吸出,并吸入少许空气;用同样的方法吸入新鲜的变性driver,此时hybridzation sample 2和新鲜变性driver在枪头内由一段气体柱分开,将这一状态的混合物打入装有hybridzation sample 1的离心管中,用枪头混匀,短暂离心。

4、68℃过夜。

5、加入200ul的dilution buffer后68℃ 保温7min。

至此杂交完成,差减杂交完毕后将进行两轮PCR扩增。

八、两次PCR扩增

第一次扩增反应体系为:

10×Taq polymerase Buffer  2ul
dNTPs(10uM) 0.4ul
Primer 1(10uM) 1ul
Taq polymerase(2U/ul) 0.5ul
ddH2O 14.1ul
第二次杂交产物 2ul
终体积 20ul

第一次扩增程序为:

step1   75℃ 5min
step2  94℃ 30sec
step3  66℃ 30sec
step4 72℃ 1.5min
step5  go to step2 34 cycles
step6  72℃ 5min
step7 4℃  hold

产物10倍稀释作为第二次PCR的模板。

第二次扩增反应体系为:

10×Taq polymerase Buffer  2ul
dNTPs(10uM) 0.4ul
nested primer 1(10uM) 1ul
nested primer 2(10uM) 1ul
Taq polymerase(2U/ul) 0.5ul
ddH2O 13.1ul
10倍稀释后的第一次PCR产物 2ul
终体积 20ul

第二次扩增反应程序为:

step1 94℃  30sec
step2  68℃ 30sec
step3 72℃ 1.5min
step4  go to step1 17 cycles
step5 72℃  5min
step6  4℃  hold

反应结束后用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

附件列表


→如果您认为本词条还有待完善,请 编辑词条

上一篇PCR佐剂手册 下一篇PCR常见问题总结

词条内容仅供参考,如果您需要解决具体问题
(尤其在法律、医学等领域),建议您咨询相关领域专业人士。
0

收藏到:  

词条信息

admin
admin
超级管理员
词条创建者 发短消息   

相关词条