一、设计原理

1、择合适的靶序列:设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守，碱基分布均匀的区域进行引物设计。

2,、长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为15～30bp.

3、 Tm值：引物的Tm值一般控制在55～60℃，尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2℃。若引物中的G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。

4、(G+C)含量:有效引物中(G+C)的比例一般为40～60%。

5、碱基的随机分布:引物中四种碱基的分布最好是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3'端不应超过3个连续的G或C.

6、 引物自身：引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列，如回文结构，发夹结构等，否则会影响到引物与模板之间的复性结合，尤其避免3'末端的互补。

二、引物设计操作流程

序列下载

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同源性比较

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引物设计筛选

1、序列查找

根据所需检测的病原体或者待检特定基因，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed 网址查询有关序列。

2,同源性比较

主要有两种方法

1）在www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi 网址进行在线的两两比较。

2）采用OMIGA, PCGENE等软件进行两两或多序列比较。

①打开OMIGA软件，导入(import)下载存盘的纯文本序列文件:

②选择待比较的多条序列，右键点击"align sequences"命令；

③等待计算机处理，直至状态显示排列结束，点击"alignment"显示结果；

④"alignment"结果，相同碱基以同色标记

三、引物设计与筛选 Primer Premier 5.0软件为例，进行引物设计和筛选的操作示范

1、打开软件，调入序列

2、选择路径，选择序列文件名，加入右框

3、序列文件显示如图，点击"primer"；

4、按照引物设计的原理，设定引物的各种参数，点击"确定"进行引物搜寻；

5、等待引物搜寻，显示结束后，点击"确定"，进入下一页；

6、按照搜寻结果显示，逐条分析，在主窗口中检查该引物对的二级结构情况，依次筛选