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引物

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一 设计引物应遵循以下原则

1 、引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。

2 、引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。

3 、引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。上下游引物的GC含量不能相差太大。附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们. 引物对的Tm差异不超过5℃, 设计时温度和GC含量是个主要的参数,做复合扩增时更要设计成相近的温度,而且引物加个尾影响不大。但要切记BLAST,包括查阅文献的引物.如果两个引物Tm不同,将退火温度设定为比最低的Tm低5℃, 或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环,然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。

4 、避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。 引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

5 、引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

6 、引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物5‘端引入酶切位点得黏性末端,随意加入3个保护性碱基,但是要注意不要形成引物二聚体,而且以A或G开头为好。

7 、引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量: 每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。

8 、引物酶切:除非产物非常特异,直接酶切PCR产物效果有时不是很好,还有一般PCR体系里过量的dNTPs会影响酶切效果。酶切后,可以用标准得乙醇沉淀法沉淀酶切产物,获得高纯度得酶切产物,也即是你的黏性目断片断供后边得试验。

9 、设计软件: 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.

二 引物保存

定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物,使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好,因为水的pH经常偏酸,会引起寡核苷的水解。 引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在 -20℃可以稳定保存6个月,但在室温(15℃到30℃)仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年,在室温(15℃到30℃)最多可以保存2个月。

三 各种PCR的引物设计

1、长距离PCR:

标准PCR的扩增长度在1~2kb间,不能满足中大型基因的扩增。在此背景下产生了长距离PCR。其引物设计原则在标准PCR的基础上还要注意一下几点:
a 、长度一般在25~30bp间;b、两条引物的解链温度趋向相等是非常重要的。如果两条引物的解链温度的差异大于1度,就可能造成错误引导以及一条链的优势扩增等问题。

2、反相PCR:

标准PCR应用于已知片断的扩增。而反相PCR应用于扩增已知片断相邻的未知片断,主要应用于a,产生探针;b,从总RNA中克隆未知cDNA序列;c、研究病毒序列、转基因和转座子的整合点位区域的序列。

其引物设计除了要注意在模板分子上的设置方向外,其它同标准原则。

3、差异显示PCR(DD-PCR):

次技术的应用在于显示细胞的全部mRNA,通过比较两种细胞或者不同环境中的同种细胞的cDNA扩增产物的电泳条带谱来鉴定基因表达图谱的差异。

其引物有两套,一为锚定引物,一为随机引物。锚定引物是由12个不同引物组成的库,序列是5'TTTTTTTTTTTTXY3'其中X可以是AGC中的任一个,Y可以是ATGC中的任一个。随机引物是由15个不同的,长度为10mer的引物组成。它们的序列都是随机形成的,都应改包含几乎相等的四种单核苷酸,G与C 碱基的平衡分布以及具有低自发形成稳定二级结构的倾向。

4、多重PCR:

多重PCR就是在PCR中使用一对以上的引物同时扩增目的DNA的几个片断,以节省模板、节约时间和减少费用。引物设计在遵守标准PCR引物设计的规则外还要保证反应中所有的引物有相近的熔解温度,引物之间不会发生相互作用,扩增产物大小相近但又能通过电泳分开。

5、热启动PCR

6、降落PCR

这两种PCR只是为了满足特别要求,在标准PCR的基础上进行了一些方法上的改进,而对引物没有什么特殊的要求,按照标准PCR的引物设计原则即可。

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