1、引物设计由美国Perkin-elmer公司合成,引物末端标记有生物素 (1)扩增体系 10×PCR buffer 5μl PCR引物 10μl 4×dNTP 10μl Taq polymerase 0.25μl DNA模板 10μl D、W 14.75μl Total 50μl (2) 扩增程序(选用PE9600扩增仪) 变性 95℃ 30Sec 退火 63℃ 30Sec 32个循环 延伸 72℃ 30Sec 最后 72℃延伸10min 注意:扩增过程各设置阳性、阴性质控扩增。 2、扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测 (1) 配制2%琼脂糖凝胶:4g琼脂糖溶于200ml×TBE缓冲液,微波炉中煮沸溶化使透明,冷却至60℃时加入10μl EB混匀; (2) 将现配制好的琼脂糖溶化凝胶液灌入制胶模具,室温放置30分钟,使其冷却固化; (3) 小心取出加样梳将已制好的凝胶放入水平式潜水电泳槽中,加1×TBE缓冲液使电极液高出胶面约1cm; (4) 将标准DNA分子量Marker和DNA参照物,置于干热器孵育5分钟; (5) 将DNA分子量Marker可见性DNA参照物及待测扩增样品5μl与上样缓冲液(loading buffer溴酚兰-二甲苯青兰)2μl混合后,按照从左向右顺序依次加入凝胶上样孔中; (6) 150V电压电泳45分钟; (7) 将电泳完毕的凝胶放置于紫外分析仪上,观察结果并照像,并与标准品对照,观察扩增效果。 3、LDLR、GYPA、HBGG、D7S8和GC五位点DNA杂交 (1) 流程示意:扩增DNA与固定在探针第六上的DNA探针杂交→洗涤除去非特异杂交的扩增DNA→HRP→SA与特异杂交的PCR产物结合→严格洗涤除去非特异结合的HRP-SA; (2) 主要配制试剂 20×SSPE buffer(3.6M NaCl,200mM NaH2PO4·2H2O 20mM EDTA PH7.4)。 20% SDS Hybridization Solution(5×SSPE,0.5% SDS) Wash Solution(2.5×SSPE,0.1%SDS) Enzyme Conjugate:HRP-SA Chromogen:TMB Solution (3) 探针设计:由美国Perkin-Elmer公司合成已制备成探针条。 4、操作步骤 (1) 准备 ①打开干热器调温度至95℃; ②调节恒温水浴摇床温度至55.5℃,检查水量是否适合,放入H、S和W、S; ③95%乙醇清洗实验台面以及所以器械; ④用铅笔标记探针条。 |
(2)步骤(以一个样本为例) ①扩增DNA 95℃变性10分钟; ②每个杂交槽中加入3.0ml H、S加入2μl 变性的扩增DNA,放入标记探针条(此步骤需在20秒内完成),55.5℃恒温水浴摇床孵育15分钟; ③弃去H、S,加5.0mlW、S洗数秒,弃去W、S; ④加3.0ml E、C、S液(3.0ml Hybridizition Solution,25μl Enzyme Corjugate:HRP-SA),55.5℃孵化5分钟,弃去E、C、S液; ⑤加5.0ml W、S洗涤数秒,弃去W、S; ⑥加5.0ml W、S,55.5℃恒温水浴摇床洗涤12分钟,弃去W、S; ⑦加5.0ml W、S,洗涤数秒,弃去W、S; 注意:杂交缓冲液和洗液使用前固体成份必须55.5℃水浴完全溶解并混匀。 5、显色、判读结果并折照 (1) 主要配制试剂 ①Citrate buffer (0.1M Trisodium Citrate PH5.0) ②Color Development Solution(用前10分钟内配制) 5.0ml Citrate buffer 5.0μl 3% Hydrogen Peroxide 0.25ml Chromogen:TMB Solution (2) 操作步骤 ①5.0ml Citrate buffer于杂交槽,置Rocker platform上室温振荡5分钟,弃去Citrate buffer; ②加5.0ml新配制Color Development buffer于每一杂交槽内,置杂交槽于Rocker platform上室温振荡20-30分钟(此步应蔽光); ③停止显色,弃去Color Development buffer,每槽内加5.0ml去离子水或蒸馏水,置于Rocker platform上室温振荡5-10分钟; ④重复步骤3)至少两次,以降低探针条背景颜色; ⑤将湿的已有分型结果DNA探针条置平滑黑色物体表面,观察判读结果并拍照。 |
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