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PCR-ASO分型技术标准

标签: PCR-ASO分型 技术标准

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1、引物设计由美国Perkin-elmer公司合成,引物末端标记有生物素

(1)扩增体系

10×PCR buffer                 5μl

PCR引物                       10μl

4×dNTP                        10μl

Taq polymerase                0.25μl

DNA模板                       10μl

D、W                          14.75μl

Total                         50μl

(2) 扩增程序(选用PE9600扩增仪)

变性              95℃              30Sec

退火              63℃              30Sec              32个循环

延伸              72℃              30Sec

最后              72℃延伸10min

注意:扩增过程各设置阳性、阴性质控扩增。

2、扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测

(1) 配制2%琼脂糖凝胶:4g琼脂糖溶于200ml×TBE缓冲液,微波炉中煮沸溶化使透明,冷却至60℃时加入10μl EB混匀;

(2) 将现配制好的琼脂糖溶化凝胶液灌入制胶模具,室温放置30分钟,使其冷却固化;

(3) 小心取出加样梳将已制好的凝胶放入水平式潜水电泳槽中,加1×TBE缓冲液使电极液高出胶面约1cm;

(4) 将标准DNA分子量Marker和DNA参照物,置于干热器孵育5分钟;

(5) 将DNA分子量Marker可见性DNA参照物及待测扩增样品5μl与上样缓冲液(loading buffer溴酚兰-二甲苯青兰)2μl混合后,按照从左向右顺序依次加入凝胶上样孔中;

(6) 150V电压电泳45分钟;

(7) 将电泳完毕的凝胶放置于紫外分析仪上,观察结果并照像,并与标准品对照,观察扩增效果。

3、LDLR、GYPA、HBGG、D7S8和GC五位点DNA杂交

(1) 流程示意:扩增DNA与固定在探针第六上的DNA探针杂交→洗涤除去非特异杂交的扩增DNA→HRP→SA与特异杂交的PCR产物结合→严格洗涤除去非特异结合的HRP-SA;

(2) 主要配制试剂

20×SSPE buffer(3.6M NaCl,200mM NaH2PO4·2H2O 20mM EDTA PH7.4)。

20% SDS

Hybridization Solution(5×SSPE,0.5% SDS)

Wash Solution(2.5×SSPE,0.1%SDS)

Enzyme Conjugate:HRP-SA

Chromogen:TMB Solution

(3) 探针设计:由美国Perkin-Elmer公司合成已制备成探针条。

4、操作步骤

(1) 准备

①打开干热器调温度至95℃;

②调节恒温水浴摇床温度至55.5℃,检查水量是否适合,放入H、S和W、S;

③95%乙醇清洗实验台面以及所以器械;

④用铅笔标记探针条。

(2)步骤(以一个样本为例)

①扩增DNA 95℃变性10分钟;

②每个杂交槽中加入3.0ml H、S加入2μl 变性的扩增DNA,放入标记探针条(此步骤需在20秒内完成),55.5℃恒温水浴摇床孵育15分钟;

③弃去H、S,加5.0mlW、S洗数秒,弃去W、S;

④加3.0ml E、C、S液(3.0ml Hybridizition Solution,25μl Enzyme Corjugate:HRP-SA),55.5℃孵化5分钟,弃去E、C、S液;

⑤加5.0ml W、S洗涤数秒,弃去W、S;

⑥加5.0ml W、S,55.5℃恒温水浴摇床洗涤12分钟,弃去W、S;

⑦加5.0ml W、S,洗涤数秒,弃去W、S;

注意:杂交缓冲液和洗液使用前固体成份必须55.5℃水浴完全溶解并混匀。

5、显色、判读结果并折照

(1) 主要配制试剂

①Citrate buffer (0.1M Trisodium Citrate PH5.0)

②Color Development Solution(用前10分钟内配制)

5.0ml Citrate buffer

5.0μl 3% Hydrogen Peroxide

0.25ml Chromogen:TMB Solution

(2) 操作步骤

①5.0ml Citrate buffer于杂交槽,置Rocker platform上室温振荡5分钟,弃去Citrate buffer;

②加5.0ml新配制Color Development buffer于每一杂交槽内,置杂交槽于Rocker platform上室温振荡20-30分钟(此步应蔽光);

③停止显色,弃去Color Development buffer,每槽内加5.0ml去离子水或蒸馏水,置于Rocker platform上室温振荡5-10分钟;

④重复步骤3)至少两次,以降低探针条背景颜色;

⑤将湿的已有分型结果DNA探针条置平滑黑色物体表面,观察判读结果并拍照。

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