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PCR及RT-PCR之基础问题解答

标签: PCR RT-PCR 问题 解答 FAQ

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RT-PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。

可能原因:

1、RNA被降解

建议解决方法

在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA;

在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA;

如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase.而且,在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂,一定要存在DTT.

2、RNA中包含逆转录抑制剂

建议解决方法:

通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元(0.25μg到0.4μg/μl)以帮助小量样品RNA的恢复。

逆转录抑制剂包括:SDS,EDTA,甘油,焦磷酸钠,spermidine,甲酰胺和胍盐。

将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。

3、多糖同RNA共沉淀

建议解决方法:

使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。

4、用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火

建议解决方法:

确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。

对于基因特异性引物(GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligo(dT)或随机六聚体。

确定GSP是反义序列。

5、起始RNA量不够

建议解决方法:

增加RNA量。

对于<50ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA.

6、RNA模板二级结构太多

建议解决方法:

将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火。

提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65℃。

注意:不要在>60℃时使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP.对于>1kb的RT-PCR产物,保持反应温度≤65℃。

注意:不要在高于37℃时使用M-MLV。

如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。

7、引物或模板对残余的RNA模板敏感

建议解决方法:

在PCR前用RNaseH处理。

8、靶序列在分析的组织中不表达

建议解决方法:

尝试其他靶序列或组织

9、PCR没有起作用

建议解决方法:

对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。

PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。

可能原因:

1、PCR引物设计较差

建议解决方法:

避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。

2、DNA含有抑制剂

建议解决方法:

诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA.

3、富含GC的模板

建议解决方法:

对于GC含量>50%的模板,使用PCRx Enhancer Solution.

4、模板浓度太低

建议解决方法:

使用104拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。

5、镁离子浓度太低

建议解决方法:

从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意:对实时定量PCR,使用3mM到5mM的镁离子浓度。

6、退火温度太高

建议解决方法:

使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。

7、引物浓度太低

建议解决方法:

最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。

RT-PCR特异性:在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。

可能原因:

1、物和模板非特异性退火

建议解决方法:

在第一链合成中使用GSP,而不是随机引物或oligo(dT)。

试用允许高温cDNA合成的GSP.

2、GSP设计较差

建议解决方法:

遵循用于扩增引物设计的同样原则

3、RNA中沾染了基因组DNA

建议解决方法:

使用扩增级DNaseⅠ处理RNA.使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。

PCR特异性:在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。

可能原因:

1、形成引物二聚体

建议解决方法:

设计在3'端没有互补序列的引物。

2、引物和模板非特异性退火

建议解决方法:

以2℃到5℃间隔增加退火温度,减少退火时间。

在开始几个循环使用较高的退火温度,然后使用较低的退火温度。

使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR.

避免在引物3'端含有2到3个dG或dC.

3、镁离子浓度太高

建议解决方法:

对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。

4、因为扩增复杂模板导致引物错误起始

建议解决方法:

使用巢式PCR或递减PCR.

5、沾染外源DNA

建议解决方法:

使用抗气雾剂的tip和UDG.

6、因为二级结构导致引物结合位点无法接近

建议解决方法:

对于GC含量>50%的模板,使用(1×-3×)PCRx Enhancer Solution.

PCR忠实性:PCR在产物序列中引入了错误

可能原因:

1、聚合酶忠实性低

建议解决方法:

使用带有校正活性的热稳定聚合酶,如Platinum Pfx DNA聚合酶。

2、循环数太多

建议解决方法:

降低循环数。

3、四种dNTP的浓度不同

建议解决方法:

制备新的dNTP混合物,保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。

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