并不是所有的实验都可以做real－time的，技术路线要选好。当你的基因表达量少或有些不表达，具体就是做普通pcr跑胶条带比较弱，不是很亮的情况下，个人觉得最好不要选择real，不容易做好，特别是融解曲线。用sbgr green染料做的话，引物设计时扩增片断最好小于250bp，太长了不好扩。预实验先rt－pcr，梯度温度扩增，寻求最佳退火温度。并确定有较亮的目的条带，试剂盒不能太差，要省钱的话可以把体系降到20ul。最好不要用普通的pcr试剂盒＋sbgr green来作real，可以做出来，但是不稳定，很耗时间精力。

有些在附件里

Real－time心得.doc