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免疫PCR系列四-免疫PCR产物检测及定量技术

标签: PCR 免疫PCR

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(1) 凝胶检测系统

用凝胶扫描仪或计算机辅助视频设备对溴化乙锭染色的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶进行定量,放射性标记的扩增产物可通过放射自显影定量测定,最近用自动DNA测序仪检测荧光标记的核酸,这种方法可准确测量扩增产物的大小,而且其检测灵敏度达fg水平,但由于自动DNA序列仪和荧光标记引物极为昂贵,所以现在仅用于研究。

(2) HPLC检测系统

此法的优点为PCR产物不用纯化,对未标记的产物灵敏度可达fg水平,对标记产物的检测限度可能更低。HPLC能区分不同分子的大小,可允许我们使用不同大小的内标衡量扩增的效率。

(3) 固相测定系统

最常用的为96孔聚苯乙烯微量滴定板,可用仪器比色或读数,可用亲合素分子通过疏水相互作用包被滴定板,此固相系统可特异结合生物素或生物素化的分子可用于生物素化的PCR产物的定量,如用生物素和地高辛双重标记的扩增产物可用微量滴定板法定量,将生物素和地高辛同时标记PCR产物的方法有三种途径:①在反应混合物中同时加入地高辛和生物素标记的脱氧核苷酸类似物(DIG-/Bio-dUTP);②加入生物素化的引物1和DIG-dUTP;③加入生物素引物1和地高辛标记的引物2.定量方方法为:双重标记的扩增产物用乙醇沉淀以去除未结合的标记物,然后加至亲合素包被的微量滴定板上温育至少2小时,洗涤数次后,与DIG抗体:AP结合物温育,根据其底物不同可产生不同的颜色,亲合素介导的固相捕获生物素标记靶分子的技术是一个有效、灵活和容易操作的技术,将成为定量PCR的一个关键技术。

(4) SPA(Scintillation Proximity Assay)系统

用亲合素包被的氟微球作为固相载体,用生物素标记引物,在扩增时掺入氟化的核苷酸,扩增完成后,加入已包被的氟微球以捕获生物素化的PCR产物,此捕获过程可使与氟微球紧密结合,氟被氘激发产生光脉冲,可用闪烁计数仪测量。与比色法相比,此法具有更大的线性范围。

(5) 点杂交检测系统

将扩增产物变性后固定于尼龙膜表面,与标记的DNA探针杂交,亦可将序列特异的寡核苷酸探针通过多聚T(poly T)尾巴固定于膜上,与变性后的已标记的扩增产物杂交,在后者由于靶基因不是直接结合于膜表面,故其反应动力学接近于液相,反应速度快,通常使用生物素化的探针或扩增产物,用亲合素-AP结合物产生颜色斑点,通过与已知浓度的标准比较颜色强度进行定量。

(6) 电化学发光检测系统

通过亲合素-生物素系统将扩增产物结合于磁性珠,然后与2,2'-联吡啶-钌螯合物(TBR)标记的探针杂交,加入三丙胺(tripropylamine,TPA)溶液,并转移至电化学发光仪的检测池,当电极的电压增加至一定水平时TPA和TBR都瞬时氧化,TPA氧化后生成一种不稳定的、具有高度还原性的中间物质,可与氧化的TBR反应,使之进入激发态,当由激发态变为基态时可发射出620nm的光,发光强度与TBR标记物的量成正比,通过发光强度对PCR产物定量,此法的敏感性为amol水平,可自动化测量。

(7) DNA酶免疫测定系统

通过抗DNA单克隆抗体与扩增产物结合、再通过酶第二抗体结合物进行定量测定。此法不需对引物和扩增产物进行标记,但易出现交叉反应和单克隆抗体昂贵的费用限制了此法的广泛应用。

(8) 激光诱导荧光检测法

首先用荧光标记物FAM(商品名)的N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物借助氨已基连接臂偶联于正向引物的5'-核苷酸上,然后PCR扩增,用毛细管电泳扩增产物,最后用氩离子激光光原检测器检测荧光强度进行定量测定。此法的优点为样本用量少,可自动化检测,快速、灵敏和高分辨率。

总之,可用上述方法对靶基因定量,其准确性可通过复管测定和利用内标使数据标准化而得到提高。由于亲合素介导的固相捕获生物素标记靶分子的技术具有有效、灵活和容易操作等特点,有较好的临床应用前景。定量PCR仍然存在技术上的问题,目前多用于研究,但在肿瘤、细菌、真菌和病毒性疾病的诊断和治疗方面对此技术的需求将日益增加。

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