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PCR检测的质量控制

标签: PCR检测 质量控制

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随着兽医防疫工作重要性的逐步提高,PCR检测技术已被兽医工作者比较广泛认可,已经从实验室研究走进了临床应用阶段。如何提高PCR检测质量,已成为实验室技术人员不可回避的一个问题,它直接影响实验室检测结果的可信度和兽医防疫工作质量。

PCR检测质量的控制是一个系统工程,总体上涉及三个方面:一是试验仪器;二是试验试剂与耗材;三是人员操作。任何一个方面出现问题,都会影响PCR检测质量。

一、试验仪器

PCR仪和紫外凝胶成像系统(紫外分析仪或手提紫外等)以及移液器都可能影响PCR检测的质量。PCR仪是控制PCR反应温度变化的,其温度和控制时间的准确程度可能会影性PCR检测质量。移液器取液的准确程度影响反应体系是否能达到最佳反应环境。紫外分析系统对检测敏感性有明显的影响。紫外分析系统有3种类型仪器:紫外分析仪、紫外凝胶成像系统、手提紫外灯。紫外分析仪直接用眼睛观察琼脂糖凝胶上DNA扩增带。紫外凝胶成像系统是在计算机上通过摄像系统对琼脂糖凝胶上DNA扩增带进行观察。手提紫外灯可以在电泳过程中直接对琼脂糖凝胶上DNA扩增带进行观察,使用方便,分辨率比较低。依据这些仪器的分辨率由高到低顺序是紫外分析仪、紫外凝胶成像系统、手提紫外灯。紫外分析仪有时能看到弱阳性扩增带,在紫外凝胶成像系统上却看不到。手提紫外灯只有在阳性扩增带比较亮时才能看到,建议为保证检测质量最好不用手提紫外灯,可用于临时的电泳结果观察。

仪器的质量控制应该通过实验室质量认证来实施,定期进行仪器的效验。没有质量认证的实验室可以定期请仪器生产厂家进行效验和保养,确保所有仪器处于正常的工作状态。

二、试验试剂与耗材

在PCR检测质量控制中,试剂的选择具有十分重要的作用,也是实验人员最为关注的检测质量控制因素。试剂一定选择质量和信誉好的厂商,一但选定后最好不要轻易改换。如果必须改换时应与原产品进行严格比对试验,包括敏感性、特异性、试剂保存期等试验。并且经常要注意不同批次产品质量的差异。比如说TaqDNA聚合酶,不同厂家生产的质量是有差异的,尽管都是标出相同活性单位,但其标定方法和保存液的成分以及运输过程的不同常常导致实际活性单位是有差异的,有时由于其活性低,使得弱阳性样品漏检;有时由于其活性过高出现非特异扩增。这与ELISA检测中酶结合物的作用相似。其实影响PCR检测结果的试剂很多,可以这样说,PCR检测用的所有试剂都可能影响检测效果。控制试剂的质量是作好PCR检测前提。我们认为:最好是选择PCR试剂盒来控制试剂质量。

评价一种PCR试剂盒,除了考虑它的敏感性、特异性、稳定性、操作简便程度外,还应包括:试剂盒提供的试剂覆盖整个PCR检测试验的程度。如果试剂盒提供了整个PCR检测试验的试剂,表明该试剂盒对PCR检测试验的试剂具有了全程控制性能。相反,PCR检测的试剂的质量控制程度比较低,意味着检测质量可控程度低。例如:溴化乙锭仅仅起荧光染料的作用,如果在阳光下长时间的照射下失效了,在紫外灯下发荧光效能降低,可能会造成一些弱阳性样品的漏检,出现假阴性。其它试剂出现问题也是一样影响检测质量。试剂盒在生产过程中,有一套试剂生产质量控制体系。每一试剂组分都经过灵敏度、敏感性、特异性质量控制的检测,在有效期内能确保每种试剂的质量。因此,选择试剂盒进行PCR检测是比较理想的控制方法。在PCR检测中,最好全部使用试剂盒提供试剂,对PCR检测质量控制有益。

实验耗材也是影响PCR检测质量的因素之一。PCR反应管薄厚以及传导热量性能等直接影响PCR检测效果。在热盖PCR仪上一般不需要加入矿物油,但有些PCR反应管盖子不严密,导致扩增过程中反应液水份蒸发,严重影响检测灵敏度。PCR反应体系是微量的,移液器的Tip头生产质量不好时,有时致使液体残留量多或洪吸作用强,导致试剂盒中试剂量不够,配置PCR反应体系不准,造成检测质量下降。

在每次PCR检测时,一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。阴性对照样品检测为阴性时,表明试验全部过程的试剂没有受到污染;阳性对照样品检测为阳性时,表明DNA提取(RNA提取、RNA反转录)、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下,才能对检测样品进行判定。因此,每次试验都应设立表明DNA提取(RNA提取、RNA反转录)、DNA扩增和电泳鉴定对照,只有设立试验全程的对照,才能证明试验结果成立。这一点对PCR和RT-PCR检测试验是非常重要的。

阳性对照在试剂盒中是必须有的组分。设立阳性对照有3种类型:第一种是用检测的病原微生物作为阳性对照。这样的直接对照优点是直观、准确、本次试验完整条件对照,可以说明此次试验是否成立。缺点是对检测过程中增加了PCR污染的指数。另外,不能表明每个检测样品对照成立。第二种是设立一种与检测病毒无关微生物作为阳性对照。优点是降低了PCR污染的危险性,并且提高了试剂盒的生物安全性。缺点是仅是参考阳性对照,不够直接、完全反映本次试验成立,也不能表明每个检测样品对照成立。可适合怕污染的实验室或要求生物安全等级高的病原微生物的检测。第三种是在每个反应管内设立参考对照,除了阳性扩增带之外,又设立一条扩增带,指示每个反应管内检测情况。检测为阳性时出现两条不同大小扩增带,阴性时出现一条扩增带。这种对照设立技术要求高,成本也高些,对照效果是最理想的,可以排除每个检测样品操作失误或试剂出现问题对检测造成的影响。由于在一个反应管内对两条模板同时进行扩增,相互之间多少有一定的干扰,因此,对病原微生物检测灵敏度或多或少有一定影响。此种对照方式可能会成为PCR对照的发展趋势。

三、人员操作

多名实验室人员曾经对相同样品同时进行检测,检测结果确实存在差异。经常检测人员比其他实验人员检测的灵敏度高10~100倍。说明PCR检测的试验确实有一定的操作技术需要熟悉和训练,不同的人员对检测结果有一定的影响。加强人员的操作技能的训练是必须的,需要实验技术人员对PCR检测有一个熟练的过程。

PCR污染控制是PCR检测操作人员必须非常注意一项内容。实验室设置上分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。物流应按分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区顺序,严禁倒流。人员操作也应非常注意,比如注意经常打扫卫生消毒、对移液器要定期进行清洗、消毒。及时试验操作简便、快速、准确等。

即使上述三个方面进行了很好的控制,仍需要密切注意每次检测结果,了解检测结果与其它相关检测方法的一致性。在实验室内部可以2人或多人之间进行PCR检测比对试验,也可以在实验室之间或国际组织之间进行比对试验。对有疑问检测结果,必须认真检查每个操作步骤,找出和改进可能出现的问题。控制PCR检测质量是实验室管理一项长期而艰巨的任务。同时要注意收集PCR检测方面标准颁布情况,根据国家和农业行业标准及时修改和改进PCR检测方法,使得检测合法化和标准化。

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