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标签: 实时荧光定量 PCR 技术

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一、实时荧光定量PCR原理

(一)定义:在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。

(二)实时原理

1、常规PCR技术:

对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时检测。

2、实时定量PCR技术:

利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析
 

3、如何对起始模板定量?

 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.

4、几个概念:

(1)扩增曲线 :

(2) 荧光阈值:
 

(3)Ct值:     

CT值的重现性:


 

5、定量原理:

理想的PCR反应:   X=X0*2n

非理想的PCR反应:  X=X0 (1+Ex)n
      n:扩增反应的循环次数
      X:第n次循环后的产物量
      X0:初始模板量
      Ex:扩增效率

5、标准曲线
 

6、绝对定量

1)确定未知样品的 C(t)值

2)通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量



 

7、DNA的荧光标记:



 

二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍

方法一:SYBR Green法

(一)工作原理

1、SYBR Green  能结合到双链DNA的小沟部位



    

 2、SYBR Green  只有和双链DNA结合后才发荧光

3、变性时,DNA双链分开,无荧光

4、复性和延伸时,形成双链DNA, SYBR Green 发荧光,在此阶段采集荧光信号。




PCR反应体系的建立及优化:

 1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性,太低,荧光信号太弱,不易检测
   2、Primer:引物的特异性高,否则扩增有杂带,定量不准
   3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物
  4、反应Buffer 体系的优化
  5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定
   6、其他与常规PCR相同

(二)应用范围

1、起始模板的测定;
  2、 基因型的分析;
  3、 融解曲线分析:可以优化PCR反应的条件,对常规PCR有指导意义,如对primer的评价;可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。

(三)优点及缺点

优点:对DNA模板没有选择性;适用于任何DNA; 使用方便;不必设计复杂探针;非常灵敏; 便宜。

 缺点:容易与非特异性双链DNA结合,产生假阳性;但可以通过融解曲线的分析,优化反应条件;   对引物特异性要求较高。

方法二:TaqMan---水解型杂交探针


 **5′端标记有报告基团(Reporter, R)  ,如FAM、VIC等 
  **3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)
  ** 探针完整,R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ,无荧光, R与Q分开,发荧光
  **Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性,可水解探针

一)工作原理



注意:每扩增一条DNA分子,释放一个荧光信号,可以在循环过程中任一点检测荧光

PCR反应的建立:

1、引物、探针的设计:

 探针Tm为68-70℃ ,<30 bp, 5’不能有G,G可能会淬灭荧光素,
  引物尽量靠近探针,扩增片段<400 bp,引物Tm为59-60℃

2、反应参数的确定:

一般为:94 ℃,10-20S
   60℃,30-60S(Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高)
   也可通过温度梯度优化退火温度72 ℃,45 S,

3、优化引物和探针浓度:获得最小Ct值,信号/背景比值的最大值 
   引物浓度:50-900nM
   探针浓度:50-250nM

4、其他与常规PCR相同

(二)优缺点

优点:
  对目标序列的高特异性
          ------阴性结果确定
  设计相对简单
         ------与目标序列某一区域互补
  重复性比较好

缺点:
  只适合一个特定的目标;
  委托公司标记,价格较高;
  不易找到本底低的探针

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