一、实时荧光定量PCR原理 (一)定义:在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。 (二)实时原理 1、常规PCR技术: 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时检测。 2、实时定量PCR技术: 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 3、如何对起始模板定量? 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析. 4、几个概念: (1)扩增曲线 : (2) 荧光阈值: (3)Ct值: CT值的重现性:
5、定量原理: 理想的PCR反应: X=X0*2n 非理想的PCR反应: X=X0 (1+Ex)n 5、标准曲线 6、绝对定量 1)确定未知样品的 C(t)值 2)通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
7、DNA的荧光标记:
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二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍 方法一:SYBR Green法 (一)工作原理 1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 3、变性时,DNA双链分开,无荧光 4、复性和延伸时,形成双链DNA, SYBR Green 发荧光,在此阶段采集荧光信号。 PCR反应体系的建立及优化: 1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性,太低,荧光信号太弱,不易检测 (二)应用范围 1、起始模板的测定; (三)优点及缺点 优点:对DNA模板没有选择性;适用于任何DNA; 使用方便;不必设计复杂探针;非常灵敏; 便宜。 缺点:容易与非特异性双链DNA结合,产生假阳性;但可以通过融解曲线的分析,优化反应条件; 对引物特异性要求较高。 |
方法二:TaqMan---水解型杂交探针 **5′端标记有报告基团(Reporter, R) ,如FAM、VIC等 (一)工作原理
PCR反应的建立: 1、引物、探针的设计: 探针Tm为68-70℃ ,<30 bp, 5’不能有G,G可能会淬灭荧光素, 2、反应参数的确定: 一般为:94 ℃,10-20S 3、优化引物和探针浓度:获得最小Ct值,信号/背景比值的最大值 4、其他与常规PCR相同 (二)优缺点 优点: 缺点: |
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