1、PCR括增的基本原理

PCR  (Polymerase Chain Reaction) 是体外高效复制DNA的技术，该技术几乎贯穿于现在分子生物学的各个领域。PCR体系由模板，特异性引物，高温聚合酶，脱氧核糖核酸几部分组成。反应过程分模板高温变性（Denaturation），引物与模板低温退火（Annealing）,引物在高温聚合酶的作用下延伸（Extention），在一定的条件下，退火和延伸可以合二为一。

2、高温聚合酶分类

高温DNA聚合酶主要用于DNA片段的高温快速扩增（合成），它以单链DNA或RNA为模板，在dNTP和Mg离子存在时，在特定的引物引导下按5’-3’的方向合成DNA。目前，用于高温DNA合成聚合酶就其本身的特性分成三类：第一类酶具有5’-3’方向的DNA合成（聚合）性能，没有3’-5’方向的外切酶特性。如Taq DNA聚合酶及其突变体。这类酶合成延伸能力比其它DNA聚合酶强，因为它不能纠正合成过程中出现的突变。第二类和第一类酶类似，它有合成特性，没有3’-5’方向的外切酶活性，即不具备保真性能。不同的是它们能以RNA为模板，合成DNA。也就是说它们具有逆转录功能。如Tth DNA聚合酶。第三类酶具有第一类酶的DNA聚合特性，不拥有第二类酶的逆转录功能，但是它们具有3’-5’方向的外切酶活性。如Pfu DNA聚合酶。正是酶本身具有的外切酶活性，Pfu能够纠正DNA扩增过程出现的错误，如点突变。不足之处是该类酶的DNA延伸能力不及其它两类。目前人们试图用各种手段来提高第三类酶的延伸性能，它在现代分子生物学实验中越来越收到重视。

3、如何选酶?

根据扩增产品的用途确定。第一类酶如Taq DNA聚合酶的主要用于检测基因或特定DNA片段是否存在，制备DNA探针，T/A克隆时在DNA片段末端添加单个碱基，和Pfu一道用于较长DNA片段的扩增。这类DNA扩增，DNA片段中可能存在的突变不影响实验结果。

第一类酶大多数使用场合，第二类酶都可以用。需要注意的是Tth的长链PCR扩增的能力不及Taq酶。人们更多注意的是Tth的逆转录功能，用它来实现基因单管单个酶的RT/PCR扩增检测。和传统的AMV和MMLV 逆转录酶相比，Tth的RT是在高温下进行的，能有效的解除RNA中的二级结构，是扩增出的基因更为完整。不足之处：Tth的RT能力不及AMV和MMLV 逆转录酶。第三类酶以Pfu DNA聚合酶为代表。Pfu是已知DNA聚合酶中，保真性最高的聚合酶。它扩增出的DNA产物，随机突变少，保证性能为Taq DNA聚合酶的10倍以上。Pfu主要用于克隆表达基因片段的合成，用于DNA突变实验。如果要求扩增DNA片段中的错误特别少，减少下游分子操作不必要的回复突变工作。高保真DNA扩增，使用Pfu DNA聚合酶是唯一的选择。需要指出的是：用Pfu的DNA扩增，突变少，但不是无突变无错误扩增。Pfu的不足之处是扩增能力较差，2kb以上的基因扩增需要优化反应条件。

将第一类或第二类与第三类酶按特定比例混合，能部分提高PCR扩增的长度和产物的保真性。我们提供的Taq Plus和SuperTaq属于这类产品。这类产品的保真性一般为Taq酶的2倍左右。S公司声称Taq Plus的保真性达到Pfu的水平是没有科学根据的,是极其不负责任的。

4、如何选择酶的供应商?

用可靠可信的酶。国外品牌公司的酶质量是有保证的。理论上生产Taq的工艺不复杂，但是从非专业性生产商出来的产品往往不做严格的产品控制，他们的价格虽然低，但是给您研究带来的潜在的威胁很大。很多公司没有生产能力，为追求最高利润，经常更换供应商。产品的稳定性受到影响。一般情况下他们不做质量控制。您买酶前最好问问他的酶是谁生产的，如果您仅仅被告知是国产和进口的，而不能告知明确的生产商，最好不要购买。

5、遇到问题怎么办?

影响DNA扩增的因数很多，酶的质量是个重要因素。 本公司提供的各类酶质量都经过严格的质量控制。使用本公司提供的各种DNA聚合酶一般可以排除产品本身的质量问题。影响DNA扩增效率的几个重要因数：模板性质和用量、Mg离子的浓度、退火温度等。实际上 PCR扩增没有什么特殊的规律，做多了，您就成为专家了。如果您还不能得到满意的答案，请直接向申能博彩咨询。

6、如果您不能扩增出产物，表明您使用的试剂或过程有问题吗？

不一定。有些扩增，您的引物，PCR扩增使用的酶，dNTP可能都没有问题，只是可能您没有使用最合适的条件。有些基因表达量就是低，常规的PCR可能就没有办法扩增出来。如果所有的基因都是那么容易扩增出来，那有那么多形式的PCR技术如槽式PCR,Hot Start PCR, LA PCR。如果有时引物设计不合理，靠扩增技术的改进也不一定能弥补。

7、RT-PCR技术难吗？

不难。但是您的心态要对。您不要指望您的基因如扩Actin那么容易，也不要指望3k的cDNA一下子就能扩增出来。我们注意到，降解现象非常严重的样品中，扩增beta Actin也是轻而易举的事情。实际上能扩增出Actin，只能说明PCR扩增系统没有问题，不能说明您的 RNA就一定完好。RT-PCR的关键是RNA的质量，如果您的RT没有问题，PCR跟不会有问题。

8、基因表达水平检测需要注意什么问题？

研究人员常常需要检测特定基因的表达水平，检测的手段很多，主要有Northern, 半定量RT-PCR, 荧光定量PCR(real time PCR),基因芯片的手段。很难用几行字来说清楚这些技术的优缺点。

Northern方式比较直观，但是难以批量进行，劳动量较大；半定量RT-PCR,被一些学员所推崇，因为很多实验室都可以做，但是半定量RT-PCR的关键要保证所有样品的可比性非常困难，内参需要与待检测基因同管扩增，但是由于内参基因表达水平太高，常常抑制检测基因的扩增，常常是分开扩，都可以扩增出来，混在一起就没有了，所以有时不能反映基因表达的实际情况。目的基因和内参基因分开扩增的所谓半定量RT-PCR，没有什么学术意义。荧光定量PCR，在学术界和临床诊断都被广泛采用，该技术能比较真实反映基因的表达水平，实时监控PCR扩增，数据处理自动化和数字化。荧光定量PCR需要采用具有5-3外切酶活性的Taq酶扩增，合成一对普通引物和一条荧光双标记的Taq-Man探针。要准雀体现表达水平，半定量RT-PCR, 荧光定量PCR扩增的循环数比常规少，扩增产物一般都要求处在线性区，如果扩增过程已到达平台区，扩增产物就不能反映基因拷贝数的高低。基因芯片的基本原理和Northern 基本相同，类似于点杂交，都是采用杂交原理，差别是基因芯片一般采用荧光探针，可以同时比较很多样品，可以批量处理和自动化。不足之处是检测设备费用高，假阳性的比较高，需要其他方式予以验证。

9、PCR扩增过程中若干影响因素？

引物：在Tris缓冲液中，引物可以低温保存相当长的时间。除非有核酸酶的污染，引物一般非常稳定。笔者使用过10年前的引物，仍然好用。问题的关键在于您的引物设计是否合理，使用过程是否规范。如果您怀疑引物有问题，可以选择重合。如果重合后，还没有改善，请查其他原因。引物到用户手头前都是以干粉形式存在的，干粉很容易丢掉，引物溶解后可以测定一下OD，将所有引物的浓度调整到一致，对实验有一定帮助。

高温聚合酶：高温聚合酶是非常稳定的，除非有蛋白酶的污染。但是不同公司提供的酶扩增是有差异的，活性定量和标示未必相同。选用表现一贯稳定的酶，而不是最便宜的。当然，便宜又好最好。

dNTP: dNTP是PCR扩增体系中最不稳定的，反复冻融会使dNTP发生降解。dNTP是由dATP,dCTP,dGTP,dTTP等摩尔组成，但是他们的稳定性不同，发生降解的程度不同，导致4种dNTP的浓度不一致，即使不发生降解，4种 dNTP如果浓度不等，PCR效率和正确率都会受到影响。建议分装小包装，减少反复动容冻融的次数。

缓冲液：缓冲液一般不容易出问题，只是使用前需要彻底融化混匀使用。如果您PCR不熟悉，使用含Mg的缓冲液。缓冲液中可以加入适量的甘油、DMSO等增强剂，目的是改善高GC含量等疑难模板的扩增。

Mg²⁺：是TAQ活性所必须的，浓度过高过低对反应都有比较大的影响。过低（<1mM），合成效率会下降，过高（>3mM），非特异性会加大。很多因素会使Mg²⁺：的实际浓度受到影响，如TE中的EDTA, 反应用的dNTP等都会螯和Mg.  　温度：变性和退火温度是主要需要考虑的。变性温度过高（一般在90-94C），时间过长（一般45-60秒足够），酶的活性会受到影响，同时影响产率。对于退火温度，过低非特异性扩增增加，过高产率会下降。需要根据引物的长度，用途，组成确定退火温度和时间。

模板：PCR 的关键之一，模板不是越多越好。可以通过倍比稀释来确定合适的浓度。纯度,不是最重要，但是不能有抑制Taq活性或螯和Mg 的试剂存在。模板的pH值接近中性为合适，否则会影响扩增体系的pH值。

10、PCR产物的克隆常用方法？

PCR扩增如采用Pfu DNA Polymerase产物末端为平端; 如用Taq DNA Polymerase扩增，PCR产物的3’末端通常为单个碱基A。 PCR产物克隆常用的方法有3。

（1）、平端克隆，但效率低，对于Taq扩增的产物需要除去3’末端通常为单个碱基A。Pfu扩增的可以直接用平端连接。

（2）、在引物两端设计合适的酶切位点，PCR扩增后，酶切克隆。但PCR产物直接酶切效率低，克隆成功率不高。

（3）、最为有效的是T/A克隆，因为它不需要知道扩增基因的DNA序列和酶切图谱。虽然用Pfu DNA Polymerase扩增的产物需要用K291-292试剂盒在DNA末端添上单个碱基A，但是添A实验非常简单，克隆的成功率非常高。