自1987年秋以来，PCR技术的应用开创性地推动了产前单基因缺陷者及携带者的 诊断。目前PCR还不能用于诊断所有已知缺陷疾病，但极大地扩大了实验诊断学家对 诊断方法的选择。JohnHopkins大学的研究人员表明，在诊断基因缺陷疾病方面PCR技 术具有快速、准确、操作灵活等特点。每项进展的实例在以后描述。在1987年10月前，我们用Southern印迹法产前诊断镰刀红细胞贫血症通常需要两周或更长时间，而 1987年10月以后，应用PCR只需2-4天。在1987年以前，几乎所有的β－地中海贫血症 的产前诊断都是通过检测在β－珠蛋白簇中连锁DNA的多态间接完成的，一般需要2-4 周。1987年10月以后，用PCR扩增β－珠蛋白基因区后，直接检测致病突变即可完成 β－地中海贫血症的产前诊断。这个方法既增加了准确性，又缩短了时间，一般只需一周时间。该项改进技术的作用:

（1）如果我们不能确定在父母双方中β－地中海 贫血的突变位置，我们还可以在1、2天之内研究β－珠蛋白基因簇中DNA的多态性；

（2）通过比较母亲与胎儿DNA序列差别来判断母亲传染的程度。这只是说明PCR对基 因诊断意味着什么的几个例子。

以下我们举几个特例具体说明PCR技术的应用： 　　

（1）通过扩增产物的打点杂交或限制性内切酶酶解方法确定已知的点突变； 　　

（2）通过对扩增产物直接测序来发现已知或未知的突变。

产前基因诊断基础知识

产前基因诊断是逐步发展起来的，而且在不断完善。1978年Kan和Dozy提出应用 与β－蛋白基因连锁的DNA多态性来间接诊断镰状红细胞贫血。此种诊断需要进行家 族性研究，以确定父母双方的多态性等位基因类型，此等位基因型是用正常β－珠蛋白基因及镰状红胞β－珠蛋白基因探知的。家族被调查成员包括夫妇俩的孩子，如没有孩子，则调查夫妇双方的父母。到1982年，通过利用MstⅡ限制性内切酶方法可以 直接产前诊断是否有镰状红细胞贫血，因为内切酶MstⅡ及其同功酶Cv嗷蛳xnNⅠ不能在突变位点降解镰状β－珠蛋白基因而可在此位点降解正常βA－珠蛋白基因。这种 改进不需家族调查，就可更准确地进行镰状贫血病的产前诊断。正是这种改进法，使直接而简便地确定致病突变成为可能，这也是我们在所有基因诊断研究中所力求的。

单基因缺陷的诊断是通过对连锁DNA多态性研究及家族研究而确定的。到1988年 底，我们利用这种方法诊断了一些患Duchenne肌营养不良症病人、大多数甲型和乙型血友病人、所有囊性纤维变性病人及Huntington氏病、神经性纤维瘤和成人多囊肾病 人。应用这种技术同时直接发现了镰状红细胞贫血、β－地中海贫血、α地中海贫血有大多数Duchenne肌营不良症、部分甲型血友病和成视网膜细胞瘤病人的致病突变。 几乎所有这些病例中，由于重要的DNA序列是已知的，所以PCR技术在产前诊断、症发前诊断及携带者发现等方面具有非常重要的价值。

应用PCR技术直接发现点突变

在点突变诊断中，继PCR技术之后可用三种技术一打点杂交、酶切分析及直接测 序。John Hopkins大学研究人员应用以下几步来诊断镰状红细胞贫血：（1）将人绒 毛膜样品（CVS）或羊水中得到的胚细胞在2MNaCl，0.1NNaOH溶液中煮沸。（2）应用 PCR技术在β珠蛋白基因5末端扩增一个725bp区，用30个循环，72℃链延伸120。 （3）用CvnI酶消化725bp扩增产物。（4）降解的产物进行电泳。（5）EB染色。（6） 紫外灯下观察DNA片段，并拍照。

在反应中选择使扩增产物含有两固定CvnI位点的引物。因此，酶解产物至少应可 见三条带。每个镰状红细胞的β珠蛋白基因含有一个381bp带，而正常βA珠蛋白基因 经酶结果已积累了大量信息，所以我们倾向选用限制性内切酶法消化经PCR扩增的产 物，而不是利用特异寡核苷酸探针经打点杂交来诊断βS突变位置的β突变位置。然 而，这种方法的的局限性（也是Southern杂交的局限性）是不能显示包括第六密码 即βS突变位置的β珠蛋白基因的缺失。因此，一个杂合子个体（含一个βS珠蛋白基 因，及一个基因缺失）与患镰刀状红细胞贫血病人（含两个βs珠蛋白基因）酶切片段的条带图形是一样的。所以，在诊断这类病人时，会遇到一些困难，最后只有调查 其双亲才能确诊。如果双亲都是βaβs基因型，这个人可确诊为镰状红细胞贫血症。 如果双亲中一个一是βa型，另一个是βaβs基因型，此人诊断为βs杂合子基因型且βs珠蛋白基因含一个缺失。由于突变引起的疾病具有一定特征，所以，理论上直接 确诊β地中海贫血是可能的。发生地中海贫血症的高危人群为地中海人、中东人、亚州印度人、中国人和黑人。到1988年底，已知引起地中海贫血的突变有60多种，引起 地中海贫血的99％等位基因特征是已知的，其余的等位基因很少或存在于易患者很少的种族中。因为每种人群有自己的β地中海贫血突变谱，一般情况下，4-6对等位基 因在任一特定种族的β地中海贫血基因中占99％以上，因此，使确定易患β地中海贫 血的夫妇二人的致病突变简单化。

通常无子女的配偶双方更应检查，因为他们的红细胞比积及血红蛋白A2含量筛选 测试似乎具有β地中海贫血特征。其方法是检查夫妻双方是否含有所在人群中觉的等位基因型。自1987年9月以来，在不利用DNA多态性和Southern分析方法情况下，在各 种簇中我们在产前明确诊断了80例地中海贫血病人，所有这些诊断是通过直接确定夫 妇及其胎儿的突变获得的，此方法通常需要把打点杂交与限制性内切酶分析法结合起来。需进行基因组序列分析的情况很少。60种地中海贫血的等位基因突变型的一半以上类型可以通过扩增产物酶切分析方法查明。对于地中海地区的夫妇，通过这种方法 可以分析无意义密码39，移码6，IVS-2，nt-1，IVS-2，nt745，IVS-1，nt-6及-87。其 余在地中海人中常见的突变，IVS-1，nt110，IVS-1，ntl和移码8全由打点杂交发现。

在打点杂交分析中，5-19％的扩增产物（通常为β珠蛋白基因从5起的一半。片 段长度为725bp）在硝酸纤维膜上点两次。对个体斑点通常是对照，以确定每个斑点代表的是阳性结果，还是阴性结果。斑点与32p标记寡核苷酸（19mer或20mer）或非 同位素标记探针杂交，探针的序列对所研究的突变是特异性的。另一组同的斑点与正 常β珠蛋白基因序列杂交，以确定所定的DNA量足够产生阳性信号。如果用突变探针 杂交结果为阴性而正常探针杂交结果为阳性，那么，我们可断定病人没有携带分析中 特写的突变基因。如果两种探针杂交结果均为阳性，病人为杂合人，病人携带有所研 究的突变基因；如果突变探针杂交显示阳性结果，而正常探针杂交为阴性，病人为所分析的突变基因纯合子。

斑点表示ASO探针与用于β地中海贫血产前诊断的β珠蛋白DNA扩增产物的杂交 情况。利用ASO突变探针与扩增DNA杂交，表明双亲携带无意义密码子39的突变。对 照样品，一般用于洗涤特异性监测，它们点在从上数第3，第4点，分别代表正常β珠 蛋白纯合子及无意密码39β地中海贫血等位基因纯合子DNA的扩增产物。上夫妇已有 孩子的DNA扩增产物只与突变的ASO杂交，而他们胎儿的扩增DNA既与突变ASO杂 交，也与正常ASO杂交，说明胎儿是β地中海贫血携带者。

在夫妻双方的DNA均经过是否含有在其种族中普遍存在的突变等位基因型的检查后，极个别的情况下，夫妇中有一个人的β地中海贫血症等位基因型仍是未知的。在 这点上，需对β珠蛋白基因上重要区段测序以确定未知的致病突变类型。用T7DNA聚合酶（测序酶）在DNA基因组扩增区上测序。这些区域DNA包括（1）启动子，外显 子－1，内含子－1，外显子2及内含子－2的5端90个核苷酸；（2）内含子2的3端300 个核苷酸和外显子3。用此方法可以确定几乎所有未知突变类型，但至少有两个例 子，在轻度β是中海贫血症等位基因携带者的β珠蛋白基因或5和3关键区中未找到突变。在我们的工作中，通过对PCR扩增的β珠蛋白基因直接测序发现了7种新的等位基因类型。Huisman在我们没研究的其他种族中也发现了一些新的等位基因。

采用PCR技术发现缺失

利用缺失的5和3端引物可以检测出中等大小片段的缺失（1-1.5bp），在印度 人群中，患β地中海贫血病人的β珠蛋白基因中通常存在一个619bp缺失片段。我们 发现在DNA中用引物可扩增产生1215bp片段，而当有619bp片段，可认为是缺失杂合 子。

缺失也可通过在PCR复合反应中没有缺失基因的产物而其它基因产物仍然存在来 测出。Chehab等自先用此法证明了在α珠蛋白产物表明，纯合缺失片段区至少有一个 珠蛋白引物序列。最近，Chamberlain把这个方法用于患Duchenne肌营养不良（NMD） 的男性的营养不良基因的研究。DMD是一种X性连锁严重的、早发肌营养不良症，主要原因是由于营养不良基因中缺失大约2000bp片段造成的。在肌营养不良基因中，大约60-70％DMD等位基因发生大片段缺失。Chamberlain等已经测出重要区的DNA序列并制 备了对这些序列及其它已知序列特异的引物。他们找出了用9种引物对进行PCR反应， 以扩增营养不良基因所在的9个不同区段，在这些区段上有80-90％的缺失已知。用这 些引物对，确定了许多缺失（见第十五章），这些缺失由用营养不良cDNA探针进行的 Southern印迹法证实。这种用PCR复合反应进行缺失分析的方法可用于快速普查，并 可在50%的男性病人中发现突变。其作家族成员还需要进行cDNA探针分析以发现有无 其它缺失，以及用DNA多态性分析检测家族内其他患者的情况。

在用复合PCR技术探测缺失方面也有两个局限性。首先，无论何时当我们研究缺 失片段时会担心扩增不出的片段实际上在基因组DNA上存在，只是由于其它未知的原 因而没扩增出来。我们采用此方法，在我们实验室曾遇到过，3个引物在某些正常样品中扩增出3种产物，而在其它的正常样品中3个引物只扩增出2个产物。因此，在解释9个引物中有8个或7个引物有扩增产物的实验结果时要非常谨慎。这意味着要进行重复实验才能确证基因缺失的存在。此外，在临床应用复合PCR技术的早期，可采用相应的营养不良cDNA探针进行Southern印迹法证实缺失片段。分析易患DMD的家族时，分析携带者是重要的，目前可采用营养不良cDNA探针进行定量Southern印迹法来 诊断携带者。