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引物的稀释和使用

标签: PCR 引物 稀释 使用

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1. Oligo DNA是以OD260单位来计算的,这是指在1ml体积1cm光程标准比色皿中,260nm波长下吸光度为1A260的Oligo溶液定义为1 OD260单位,根据此定义,1 OD260单位相当于33μg的Oligo DNA,您可以根据此数据和您的Oligo DNA分子量,计算得到摩尔数以计算不同摩尔浓度的溶液。

2. 引物序列的分子量计算公式如下:

MW=(A碱基数×312)+(C碱基数×288)+(G碱基数×328)+(T碱基数×303)-61

例如:引物TGGGCGGCGGTTGGTGTTACG   A=1  C=3  G=11  T=6

MW=(1×312)+(3×328)+(6×303)-61=6541

3. Oligo DNA的分子量也可以用以下近似方法计算:Oligo DNA中的每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为324.5,则一条Oligo DNA的分子量=碱基数×324.5。

例:您得到一管标为5 OD260的20 mer Oligo DNA

分子量=20×324.5=6490

质量数=5×33=165μg

摩尔数=165/6490=0.025μmol=25nmol

若加灭菌双蒸水400μl溶解,则浓度为25nmol/400μl=62.5μM

4. 装有引物的eppendorf管一般保存于-20℃,临用前稀释。

5. 由于Oligo DNA呈很轻的干膜状附在管壁上,打开时极易散失,所以打开管子前请先离心10,000rpm,1min,然后再慢慢打开管盖。

6. 在装有引物的eppendorf管内加入100-500μl双蒸水,盖上管盖,充分上下振荡5-10分钟,再次离心10,000rpm,1min.

7. 计算原引物管primer的浓度(必要时测OD260核对厂家提供引物量是否正确)。

8. 计算并将应用primer稀释为10pmol/μl。

9. 标明原引物管、应用引物管、稀释方法,置-20℃保存。

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